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流氓額怕水新蟲 (小有名氣)
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[交流]
羧基聚苯乙烯微球表面抗體修飾 已有3人參與
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請(qǐng)問大家是怎么在微球表面進(jìn)行抗體修飾的呀？我是在在MES緩沖液中加入100μl 羧基修飾的PS球，然后用EDC/NHS進(jìn)行活化處理，洗球后在加入0.5mg/ml的單抗，4℃保存一夜。但是后面檢測(cè)蛋白并沒有信號(hào)感覺是抗體沒有修飾上去，不知道有沒有大佬做過類似的修飾，還請(qǐng)幫助 |
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2樓2022-05-24 10:42:28
流氓額怕水
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3樓2022-05-24 13:45:01
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| 一般常規(guī)抗體偶聯(lián)不需要4℃，除非你的微球供應(yīng)商操作手冊(cè)有明確要求；每步離心后需要充分再懸浮，保證微球的分散狀態(tài)，普通振蕩或渦旋達(dá)不到需求，量少水浴超聲分散，量多要上超聲設(shè)備了，所謂破壞抗體情況多在于超聲局部溫度升高所致，優(yōu)化超聲控制，你可以控制單次超聲秒數(shù)及頻率和總時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)可以上冰浴；如果沒有明確無需洗滌，活化前可能需要洗球，去除雜質(zhì)及多余的表面活性劑；活化時(shí)間不易過長(zhǎng)；MES緩沖液適合洗滌及活化，PH不適合偶聯(lián)，需要按照7.4的PH基礎(chǔ)去優(yōu)化偶聯(lián)緩沖液，但該P(yáng)H及以上條件下羧基活化中間體不穩(wěn)定，所以也就沒必要過夜，37℃搖床偶聯(lián)1小時(shí)左右即可，封閉后的微球保存液也一樣要合適，可以維持標(biāo)記物穩(wěn)定 |
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流氓額怕水4樓2022-05-24 15:25:46
流氓額怕水
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5樓2022-05-24 15:50:26
6樓2022-05-24 17:28:09
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7樓2022-05-24 18:37:04
consequently
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8樓2022-06-02 17:44:41
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樓主，我想請(qǐng)教一下，我用多抗化學(xué)偶聯(lián)羧基膠乳微球，抗體等電點(diǎn)5～6，微球先在MES中用EDC、NHS活化，清洗后偶聯(lián)抗體：第一種：在pH6.0的100mM MES中偶聯(lián)，加入抗體后發(fā)現(xiàn)很快就出現(xiàn)絮狀聚集，偶聯(lián)3h后超聲，前幾次超開過，后來做了幾次一直超不開；第二種：在pH7.4的100mM PBS中偶聯(lián)，加入抗體后未發(fā)現(xiàn)聚集，但是偶聯(lián)3h后離心，發(fā)現(xiàn)離心不下來（離心力和清洗裸微球時(shí)用的一樣大，清洗時(shí)可以離心下來）。 請(qǐng)問在第一種方法中出現(xiàn)聚集的原因是什么呢，第二種方法中為什么偶聯(lián)抗體后會(huì)離心不下來？ 十分困惑，非常期待您的解答！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2024-10-10 00:13:01
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