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Western blot 轉(zhuǎn)膜使用甲醇問題求教 已有2人參與
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Western blot轉(zhuǎn)膜液里為什么要加20%甲醇？？我搜索并得到以下解釋，但不確定是否正確： 1、甲醇可以可以減少電流，從而降低產(chǎn)熱。 疑問：直接設(shè)置更低的轉(zhuǎn)膜電壓不就可以了，何必加甲醇。 2、甲醇可以去除蛋白上的SDS 疑問：SDS去除了如何保證蛋白向正極移動。 3、不加甲醇蛋白轉(zhuǎn)不上膜 疑問：這個說法的原理是什么？我曾用過購買的10× 轉(zhuǎn)膜液， 直接用水稀釋即可使用，蛋白完全能順利轉(zhuǎn)上膜，之后也blot出了條帶。 |
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lirol
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| （從別處粘來的，覺得這個解釋更合理些，由于甲醇有一定的毒性，我們是用的乙醇，使用效果也不錯。）PVDF膜一定要在純甲醇里浸潤的！不然蛋白結(jié)合不上去。在100%甲醇里短暫浸潤,其目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。小分子及大分子量的蛋白轉(zhuǎn)移時，多加或不加甲醇也是這個目的。因?yàn)樾》肿硬蝗菀缀湍そY(jié)合而大分子更容易。轉(zhuǎn)膜的過程，是一個恒定電場下，電荷轉(zhuǎn)移的過程。這個過程中，蛋白的轉(zhuǎn)移和電場強(qiáng)度以及自身電荷有關(guān)。你加入的甲醇主要是降低電導(dǎo)的作用。防止你的溶液過熱。 |
2樓2019-04-12 08:44:57
匿名
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3樓2019-04-12 08:54:57
4樓2019-04-12 15:46:32
lirol
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5樓2019-04-12 16:02:45
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我找到了其他課題組也用乙醇代替的回答。 我覺得降低電導(dǎo)防止過熱沒有必要用甲醇，畢竟太毒了，不劃算，開始使就用冰的buffer，設(shè)置更小的電壓就行了。 也有人表示轉(zhuǎn)膜不用甲醇是可以的（活化的時候還是要的）。加了甲醇有利于蛋白分子更好的結(jié)合到膜上，等等。以下連接給你參考： https://www.researchgate.net/pos ... the_transfer_buffer |
6樓2019-04-12 19:37:02
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以下是我找到的答案，供大家參考。 https://www.researchgate.net/pos ... the_transfer_buffer 結(jié)論是：加了甲醇有利于蛋白的固定到膜上，特別是小分子的蛋白，對于大分子的蛋白可能是不利的，乙醇可以代替甲醇使用。 Thermo fisher官網(wǎng)的說明： Methanol in the transfer buffer aids in stripping the SDS from proteins in SDS-PAGE gels, increasing their ability to bind to support membranes. However, methanol can inactivate enzymes required for downstream analyses, and it can shrink the gel and membrane, which may increase the transfer time of large molecular weight proteins (150,000 Da) with poor solubility in methanol. In the absence of methanol, though, protein gels may swell in low ionic strength buffers, and therefore it is recommended to pre-swell gels for 30 minutes to 1 hour to prevent band distortion. |
7樓2019-04-12 19:41:58
8樓2019-06-10 12:31:09
好學(xué)生。。。
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