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tq0ax1r新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
蛋白不掛鎳柱，關(guān)于變性上柱的問(wèn)題 已有1人參與
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蛋白n端有6histag + mbp, 現(xiàn)在用鎳柱純化，發(fā)現(xiàn)蛋白幾乎全在flow through里。（大家可能要問(wèn)我為什么不用amylose resin既然有mbp的話。我的蛋白是個(gè)膜蛋白，雖然mbp提高了溶解性，目前還加著去垢劑，無(wú)法確定去垢劑是否會(huì)影響amylose binding。并且用該柱純化后需要透析，在這過(guò)程中會(huì)透析掉去垢劑，不確定這樣蛋白會(huì)不會(huì)沉淀。）所以目前是先計(jì)劃變性后再上鎳柱，這個(gè)蛋白里cystein相當(dāng)多，也就是說(shuō)二硫鍵多，當(dāng)然也會(huì)形成多聚體，我的問(wèn)題是在變性上柱的buffer里加了8m尿素，還要不要加個(gè)5mm 巰基乙醇（這點(diǎn)是否夠）？查看了別人的做法是上柱前加巰基乙醇，洗柱子的buffer里不加，最后洗脫液里再加巰基乙醇，不知道這最后一步是不是為了蛋白在被洗脫下來(lái)的過(guò)程中不形成多聚體？我是希望在柱上復(fù)性的，所以洗脫液里不打算加尿素。不知道洗脫液里能不能不加巰基乙醇？不加會(huì)怎樣？請(qǐng)大家給點(diǎn)建議！多謝了！ (質(zhì)粒測(cè)序正確，表達(dá)后跑過(guò)sdspage已看到表達(dá)的蛋白條帶。沒(méi)加目標(biāo)蛋白前，空載體能表達(dá)6histag-MBP, 并且能在鎳柱上純化出來(lái)MBP。為什么在它C端加了目標(biāo)蛋白后就掛不上柱子了呢？是因?yàn)槟繕?biāo)蛋白使得形成了多聚體或包涵體嗎？) |
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可能是蛋白形成聚集體造成空間位阻，可嘗試XL系列有延伸臂或者專(zhuān)門(mén)做大分子的填料。因?yàn)槭悄さ鞍�，可能是因�(yàn)槭杷饔幂^強(qiáng)，形成了膠束，我之前做的一個(gè)膜蛋白，是在蛋白液里面加終濃度0.5%的SDS才能掛柱的，你可以嘗試一下，不過(guò)要考慮去垢劑的去除問(wèn)題，祝你早日成功！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
5樓2019-05-11 20:22:53
panbenxun
木蟲(chóng) (小有名氣)
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2樓2019-03-22 18:50:27
tq0ax1r
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已經(jīng)是帶著去垢劑純化的了，我現(xiàn)在在想是不是去垢劑的問(wèn)題，想不用，當(dāng)可溶性蛋白純化試試 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2019-03-23 09:48:19
zrf519
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4樓2019-04-11 15:19:47
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