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tq0ax1r新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白不掛鎳柱，關(guān)于變性上柱的問題 已有1人參與
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蛋白n端有6histag + mbp, 現(xiàn)在用鎳柱純化，發(fā)現(xiàn)蛋白幾乎全在flow through里。（大家可能要問我為什么不用amylose resin既然有mbp的話。我的蛋白是個(gè)膜蛋白，雖然mbp提高了溶解性，目前還加著去垢劑，無法確定去垢劑是否會(huì)影響amylose binding。并且用該柱純化后需要透析，在這過程中會(huì)透析掉去垢劑，不確定這樣蛋白會(huì)不會(huì)沉淀。）所以目前是先計(jì)劃變性后再上鎳柱，這個(gè)蛋白里cystein相當(dāng)多，也就是說二硫鍵多，當(dāng)然也會(huì)形成多聚體，我的問題是在變性上柱的buffer里加了8m尿素，還要不要加個(gè)5mm 巰基乙醇（這點(diǎn)是否夠）？查看了別人的做法是上柱前加巰基乙醇，洗柱子的buffer里不加，最后洗脫液里再加巰基乙醇，不知道這最后一步是不是為了蛋白在被洗脫下來的過程中不形成多聚體？我是希望在柱上復(fù)性的，所以洗脫液里不打算加尿素。不知道洗脫液里能不能不加巰基乙醇？不加會(huì)怎樣？請大家給點(diǎn)建議！多謝了！ (質(zhì)粒測序正確，表達(dá)后跑過sdspage已看到表達(dá)的蛋白條帶。沒加目標(biāo)蛋白前，空載體能表達(dá)6histag-MBP, 并且能在鎳柱上純化出來MBP。為什么在它C端加了目標(biāo)蛋白后就掛不上柱子了呢？是因?yàn)槟繕?biāo)蛋白使得形成了多聚體或包涵體嗎？) |
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panbenxun
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2樓2019-03-22 18:50:27
tq0ax1r
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4樓2019-04-11 15:19:47
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可能是蛋白形成聚集體造成空間位阻，可嘗試XL系列有延伸臂或者專門做大分子的填料。因?yàn)槭悄さ鞍祝赡苁且驗(yàn)槭杷饔幂^強(qiáng)，形成了膠束，我之前做的一個(gè)膜蛋白，是在蛋白液里面加終濃度0.5%的SDS才能掛柱的，你可以嘗試一下，不過要考慮去垢劑的去除問題，祝你早日成功！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2019-05-11 20:22:53
yubeihong
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6樓2019-09-20 18:26:26
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