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對羥基聯(lián)苯比色法測乳酸含量的原理
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乳酸含量的測定，除高效液相、氣相和離子色譜外，還有一種較為為常用且精確度很好的方法就是對羥基聯(lián)苯比色法。由于實驗室條件和樣品量的關(guān)系，我最終確定用對羥基聯(lián)苯比色法測乳酸。但是在整理具體分析方法的時候發(fā)現(xiàn)，不同文獻中，所述實驗原理和分析步驟有較大差別�，F(xiàn)具體敘述，想和大家交流一下。 各文獻所述 基本原理是：乳酸與濃硫酸共熱被氧化為乙醛，然后乙醛與對羥基聯(lián)苯發(fā)生顯色反應(yīng)，所呈顏色在w波長（565 nm，570 nm均有出現(xiàn)）下具有特征吸收峰，在一定范圍內(nèi)，乳酸含量與該峰處的吸光度呈線性關(guān)系。 但是反應(yīng)期間有銅離子的催化作用，二其催化作用發(fā)揮在那個階段，不同文獻的表述不一。大部分中文文獻中：乳酸在銅離子的催化下，與濃硫酸作用生成乙醛，乙醛能與對羥基聯(lián)苯作用生成在w波長 處有特征吸收的紫色物質(zhì)；在一定濃度范圍內(nèi)，乳酸含量與w波長 處吸光度呈線性關(guān)系，因此可以通過測定w波長 處的吸光度來測定乳酸的含量。而在外文文獻中，銅離子發(fā)揮催化作用是在乙醛與對羥基聯(lián)苯間顯色反應(yīng)階段（兩篇：[1] barker s b, summerson w h. the colorimetric determination of lactic acid in biological material[j]. journal of biological chemistry, 1941, 138(2): 535-554.；[2] barnett a j. the colorimetric determination of lactic acid in silage[j]. biochemical journal, 1951, 49(4): 527-529.）。 另外，對于銅離子添加的時間：一種是在前面：加待測液后，加入4%（w/v）硫酸銅溶液，再加濃硫酸，再加對羥基聯(lián)苯試劑進行顯色；一種是在后面：加待測液，之后加濃硫酸，之后加4%（w/v）硫酸銅溶液，再加對羥基聯(lián)苯試劑進行顯色。到底哪個階段前加銅離子，是在氧化乳酸成乙醛階段前添加，還是氧化階段后乙醛與對羥基聯(lián)苯顯色階段前添加，還是只要在乙醛與對羥基聯(lián)苯顯色階段前添加便可？ 所以，這里的問題就是：(1)銅離子發(fā)揮催化作用的階段，是催化乳酸與濃硫酸反應(yīng)生成乙醛，還是催化乙醛與對羥基聯(lián)苯顯色反應(yīng)，還是對兩種反應(yīng)均有催化作用；(2)硫酸銅溶液添加時間，是在加入待測液之后便添加硫酸銅溶液，還是在乳酸與濃硫酸反應(yīng)之后且加對羥基聯(lián)苯顯色之前添加。 歡迎大家參與討論，提出寶貴建議。 謝謝。 |
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