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zhiqiang2013新蟲 (初入文壇)
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蛋白質(zhì)濃度測(cè)定UV法、BCA法、考馬斯亮藍(lán)法3種常用方法比較 已有3人參與
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測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法有很多，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法，雙縮脲法，BCA方法，Lowry法，考馬斯亮藍(lán)法，凱氏定氮法等等，今天酶聯(lián)生物以UV法，BCA法，考馬斯亮藍(lán)法，其中的三種方法的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、操作以及注意事項(xiàng)做詳細(xì)介紹。 UV法 這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。 1.簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor 2.精確計(jì)算 通過計(jì)算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計(jì)算最終結(jié)果： �、�、蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D ②、其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度 ③、D為溶液的稀釋倍數(shù) BCA法 原理：BCA（bicinchoninincacid）與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，工作試劑由原來的蘋果綠色變?yōu)樽仙珡?fù)合物。562nm下其光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。 考馬斯亮藍(lán)法 實(shí)驗(yàn)原理：考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。 考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 突出優(yōu)點(diǎn) （1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。 �。�2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和需要嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。 缺點(diǎn) （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。 �。�2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。 希望上述3種方法祝您在蛋白質(zhì)濃度測(cè)定中有所幫助，大家可以結(jié)合對(duì)比選擇適合自己的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法。還有疑問，歡迎留言交流！  |
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