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zhiqiang2013新蟲 (初入文壇)
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蛋白質(zhì)濃度測定UV法、BCA法、考馬斯亮藍(lán)法3種常用方法比較 已有3人參與
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測定蛋白質(zhì)濃度的方法有很多，科研工作者廣泛使用的方法比如紫外吸收法，雙縮脲法，BCA方法，Lowry法，考馬斯亮藍(lán)法，凱氏定氮法等等，今天酶聯(lián)生物以UV法，BCA法，考馬斯亮藍(lán)法，其中的三種方法的測定蛋白質(zhì)濃度的原理、優(yōu)缺點、操作以及注意事項做詳細(xì)介紹。 UV法 這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。 1.簡易經(jīng)驗公式 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor 2.精確計算 通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算最終結(jié)果： �、佟⒌鞍踪|(zhì)濃度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D �、凇⑵渲衐為測定OD值比色杯的厚度 �、�、D為溶液的稀釋倍數(shù) BCA法 原理：BCA（bicinchoninincacid）與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，工作試劑由原來的蘋果綠色變?yōu)樽仙珡?fù)合物。562nm下其光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。 考馬斯亮藍(lán)法 實驗原理：考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBrilliantBlue)法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法之一。 考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 突出優(yōu)點 （1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。 �。�2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和需要嚴(yán)格地控制時間。 �。�3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。 缺點 （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。 （2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等。 希望上述3種方法祝您在蛋白質(zhì)濃度測定中有所幫助，大家可以結(jié)合對比選擇適合自己的蛋白質(zhì)濃度測定方法。還有疑問，歡迎留言交流！  |
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