在线免费播放亚洲自拍网 ,91麻豆国产福利在线观看精品,超碰在线caoporon

版塊導航: 正在加載中...

客戶端APP下載

論文輔導

調劑小程序

登錄注冊

應《網絡安全法》要求，自2017年10月1日起，未進行實名認證將不得使用互聯網跟帖服務。為保障您的帳號能夠正常使用，請盡快對帳號進行手機號驗證，感謝您的理解與支持！

24小時熱門版塊排行榜

返回列表

當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖

NanoFCMlxq

新蟲 (正式寫手)

應助: 0 (幼兒園)
金幣: 1017.6
帖子: 787
在線: 8.6小時
蟲號: 26342463

32金幣

外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（十一）: 領取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

掃一掃，下載小木蟲客戶端

今天分享一篇發(fā)表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名為《Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution》[1]（在單囊泡和單分子水平定量評估裝載入工程化細胞外囊泡的蛋白含量）。

細胞外囊泡(EVs)是一種幾乎所有細胞都會分泌的納米顆粒，分泌到細胞外或體液中，通過功能性生物分子的轉移傳遞細胞間通信。EV已被探索用于治療人類疾病的藥物分子的天然傳遞載體。事實上，EV作為細胞內傳遞各種治療藥物的新候選藥物已經顯示出了巨大的潛力，包括合成的小分子和生物分子，如RNA和大蛋白質。此外，與合成遞送系統相比，這些囊泡有幾個優(yōu)點：體積小、免疫原性低、缺乏細胞毒性、長期安全性和易于通過多種策略裝載藥物。

可以用感興趣的分子工程化EV來修飾其裝載物組成。其中EV的蛋白修飾通常是通過細胞工程實現的，使用編碼和過表達目標蛋白的質粒，這個目的蛋白是融合了腔內或膜上參與EV自然發(fā)生發(fā)展的蛋白。為達到此目的選擇的EV蛋白通常在EV制劑中富集，有可能促進裝載物高效率裝載進入囊泡，在這里被稱為EV分選蛋白。常用的EV分選蛋白包括四酯蛋白（特別是CD63、CD9和CD81)、lamp2b和乳酸酯蛋白的C1C2結構域。將所選擇的裝載物蛋白與EV分選蛋白融合是通過親代細胞工程將裝載物蛋白裝載到EV中最常見的策略。這種方法既允許在腔內儲存定向輸送到靶細胞的裝載物，也可以在EV表面展示裝載物，通過與靶細胞表面受體的直接相互作用，增強其治療信號特性或靶向能力。據報道，已成功裝入EV的蛋白包括用于體外和體內EV追蹤的熒光素酶和熒光蛋白、EV靶向的抗體和多肽、活性酶、用于同時裝載RNA的RNA結合蛋白和疫苗免疫原等。有趣的是，許多這些研究表明，裝載EV的蛋白的富集水平依賴于所使用的EV分選蛋白。然而，對不同EV分選蛋白的裝載效率的綜合比較仍僅限于少數候選蛋白，目前缺乏定量分析的工具。

細胞中有多種生物發(fā)生途徑導致EV的釋放，這解釋了細胞條件培養(yǎng)基中存在不同成分的囊泡群。即使用目前最專精的方法分離的原代或工程化EV仍具有異質性，并包含具有不同組成的囊泡亞群。對EV的評估主要局限于大量蛋白質含量分析的方法，如免疫印跡、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、EV結合珠子的常規(guī)流式細胞術和質譜，這些方法都不適合單囊泡表征。最近有幾種單囊泡分析的技術，可以更準確地評估蛋白裝載物，其中一些方法還達到單分子水平。其中包括透射電子顯微鏡(TEM)結合免疫金標記、原子力顯微鏡、超分辨率熒光顯微鏡、熒光相關光譜、納米流式檢測儀（NanoFCM）、成像流式細胞術、單粒子干涉反射率成像傳感（SP-IRIS）和激光鑷子拉曼光譜。重要的是，這些方法揭示了裝載物在原代和工程化EV亞群中的異質分布，突出了在EV標準特征中對高分辨率技術的要求。

本研究旨在探索和驗證在單囊泡和單分子水平上分析工程EV的技術，以快速和穩(wěn)定地評價不同EV分選蛋白在促進蛋白裝載物方面的效率。Expi293F細胞被設計成分泌含有綠色熒光蛋白(GFP)的EV，該GFP與在EV中高度富集的選定的膜相關蛋白融合。使用免疫印跡技術（WB）批量分析小EV中的GFP水平，并與新型高分辨率單囊泡分析方法納米流式（NanoFCM）、ExoView和單分子定位顯微鏡(SMLM)進行比較。我們的研究結果驗證了使用NanoFCM N30設備和ExoView作為快速和可靠的工程EV單囊泡分析技術，捕獲了在EV亞群中的異質性GFP分布。SMLM被證實是最準確的方法，可以定量分析單個EV中裝載的GFP拷貝數。GFP富集水平的比較分析融合不同EV分類蛋白也顯示了新的適合將蛋白裝載物高效裝載進入EV的候選蛋白，進一步擴大EV分類蛋白的范圍，可用于生成增強靶向目標細胞能力和輸送功能化治療藥物的工程化EV。

研究過程：

一、EV分選蛋白的選擇和生物信息學特征

Vesiclepedia數據庫(Home - Extracellular vesicles database)、 ExoCarta(https://exocarta.org)和EVpedia(https://evpedia.info)查詢人類EV蛋白，并進一步選擇小于50kDa的蛋白質對應的條目。通過文獻檢索，我們選擇了能夠耐受融合且不對EV生物發(fā)生產生負面影響的蛋白。EV蛋白和GFP序列從UniProt（條目ID：CD47：Q08722；SDCBP：O00560、APMAP：Q9HDC9、TSPAN14：Q8NG11、CD63：P08962、CD81：P60033、PDGFRβ：P09619；GFP：C5MKY7，攜帶V2A、F65L、S66L和H232L增強熒光），生成融合蛋白（蛋白序列見表S1）。融合蛋白的膜拓撲結構由UniProt注釋和之前發(fā)表的關于EV分類蛋白的文獻來推測。

二、設計質粒

利用人種蛋白表達的密碼子優(yōu)化，將GFP融合域和GFP融合蛋白序列反向翻譯成DNA序列。合成DNA插入物并克隆到pEBNAZ表達載體中的SacII和NotI位點，在CMV啟動子控制下進行重組蛋白表達。所有的構建物均通過GenScript進行采購。

三、細胞培養(yǎng)

Expi293F懸浮細胞來源于293F人胚胎腎細胞，購自ThermoFisher。細胞以0.5-1×10^6個細胞/ml的密度接種，在化學限定、無血清、無蛋白的Expi293表達培養(yǎng)基中培養(yǎng)至3-4×10^6個細胞/ml的密度，37?C，8%CO2(150rpm)。使用CedexHiRes分析儀（Roche）計數細胞和測量細胞活力。細胞一直使用到第21代。所有細胞均為支原體陰性，并經短串聯重復序列DNA譜分析鑒定。

四、細胞轉染進行EV生產

將Expi293F細胞以3.9×10^6個細胞/ml的密度接種于45ml的Expi293表達培養(yǎng)基中，置于500ml的康寧錐形細胞培養(yǎng)瓶中。將質粒DNA(75μg)在Expi293表達培養(yǎng)基中稀釋，并與40kDa鹽酸線性聚乙烯亞胺120μg/ml（(Polysciences）以1：1(v/v)的比例在Expi293表達培養(yǎng)基中混合。該混合物在室溫(RT)孵育15min，然后輕輕加入細胞。在相同條件下用無DNA的聚乙烯亞胺復合物處理的細胞作為未轉染的對照。24h后，在每個細胞培養(yǎng)瓶中加入50ml新鮮培養(yǎng)基。細胞維持在37?C，8%CO2，150rpm。

五、細胞成像和流式細胞術分析

轉染48小時后，對照和轉染的Expi293F細胞用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(VWR)固定，細胞核用Hoechst33342染色（ThermoFisher)。然后將細胞在PBS中重懸，轉移到96孔的細胞載體超板(PerkinElmer)中，短暫旋轉將細胞沉積到底部，并立即在旋轉圓盤共聚焦CV7000顯微鏡（Yokogawa）中使用40倍物鏡(NA0.75)和激光405nm(BP447/45nm)和488nm(BP522/35nm)進行成像。每孔有6個視野成像，記錄每個位置。使用ImageJ1.52p軟件對圖像進行處理。使用配備BDFACSDiva軟件(BD Biosciences)流式細胞儀進行流式細胞分析，在門中獲得10000個events。數據采用FlowJo v10.7.1軟件進行分析。以非轉染對照細胞的GFP背景熒光水平作為定義GFP+細胞群體的閾值。

六、EV分離

細胞轉染48h后，將細胞培養(yǎng)上清液以300xg離心10min去除細胞，將澄清的上清液轉入新管中，2500xg離心30min，4?C，清除殘留的細胞碎片和凋亡小體。然后，將上清液轉移到94ml快速密封超離心管（Beckman Coulter）中，以20000xg離心25min，4?C，去除大EV。在OptimaXPN-80超離心機中使用了一個45Ti轉子（Beckman Coulter）。然后將上清液轉移到新的試管中，使用相同的轉子(k因子=210.4)在100000xg超離心2小時。用PBS再懸浮洗滌，再重復一次操作。EV在100-200μlPBS中重懸，并在?80?C下冷凍，以待下一步操作。

七、EV的透射電鏡觀察

EV懸浮液在2%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)PBS中固定30min。使用Bal-TecMED020涂層系統，碳涂層100網銅網格在7.2V下發(fā)光放電60秒，EV樣品立即在網格上孵育15min，4?C。然后用PBS洗滌網格，用1%戊二醛(Sigma-Aldrich)在4?C下固定5min，再次洗滌，用濾紙吸干。吸附在網格上的EV用2%醋酸鈾酰水溶液（Sigma-Aldrich）負染2min，然后使用FEITecnaiG2Spigirt號透射電子顯微鏡（ThermoFisher）清洗、干燥和分析。

八、EV的納米顆粒跟蹤分析

使用配備藍色激光(488nm，70mW)和CMOS相機(MM14c)的NanoSight LM14c分析尺寸分布和顆粒濃度。樣品用PBS稀釋從1000到8000倍，在所有條件下測量20-100個粒子/幀，以100 a.u. 的速度注射到測量室，每次測90s。數據采集的設備設置在測量之間保持不變，相機水平設置為15，自動設置關閉，屏幕增益設置為1，閾值設置為7。數據分析采用NTA 3.2軟件(Malvern)進行。

九、EV和細胞裂解物的蛋白印跡分析

轉染后48小時收集細胞，用PBS洗滌，用PierceRIPA緩沖液，添加無EDTA蛋白酶抑制劑cocktail(Sigma-Aldrich)冰上裂解30min。裂解液在4?C下14000rpm離心10min，上清在?20?C下保存。用Qubit蛋白檢測試劑盒定量EV懸液和細胞裂解物的蛋白濃度。（省略步驟，常規(guī)WB操作）

十、EV免疫標記及納米流式分析

EV(5×10^11顆粒/ml)用CellTrace遠紅染料5μM標記15min。然后，用裝有TLA-55轉子的臺式超離心機，用PBS超離心洗滌，去除多余的染料。

EV在納米流式N30儀器(NanoFCM)上進行分析。EV樣品在分析前用PBS稀釋，以便在分析期間記錄2000-12000個顆粒數據。粒子信號采集采用10mW的藍色激光488nm/20mW紅色激光638nm，10%SS衰減，用1.0kPa的采樣壓力。采用單光子計數APD探測器的光散射和熒光采集方法，分別為側散射(SSC)FF01-488/24（觸發(fā)通道）、524/20和670/30帶通濾波片。以HPLC級水作為鞘液，將樣品流聚焦至～1.4μm。使用已知濃度的250nm二氧化硅納米球(用于EV濃度計算)，以及NanoFCM生產的含有68、91、113和155nm(用于EV尺寸計算)的納米球進行校準測量。PBS用于定義閾值。數據通過NanoFCM專業(yè)軟件v1.8軟件生成。使用PBS對所有數據進行背景校正，以未轉染Expi293F細胞的EV作為熒光陰性對照。

十一、用ExoView分析EV

將EV在溶液A(含有Tween-20的專有配方)中稀釋，將35μl樣品在ExoView四酯蛋白芯片(EV-TC-TTS-01)上RT孵育16小時，放置在密封的24孔板中。該芯片包被了cd63、cd81或cd9抗體，用于EV群體表征，或小鼠IgG1κ匹配同型抗體，用作非特異性EV結合的對照。然后在1ml溶液A中洗滌3次，3min，輕輕搖晃，然后用ExoView四酯酶標記抗體混合(EV-TC-AB-01)在RT下孵育1小時，含有CF647偶聯抗cd63、抗cd81和抗cd9抗體和CF555偶聯抗GFP抗體，全部在BSA2%的A溶液中稀釋1：5000。然后在溶液A中清洗一次，在溶液B中清洗三次，然后用過濾過的去離子水沖洗并干燥。溶液A和溶液B提供了ExoView四酯蛋白芯片試劑盒(EV-TC-TTS-01)。然后，使用ExoScan2.5.5采集軟件，使用ExoViewR100對芯片進行成像。使用ExoViewer2.5.0軟件對獲得的圖像進行分析，EV尺寸閾值設置為50-200nm直徑。

十二、用單分子定位顯微鏡分析EV

轉染細胞和對照細胞的EV在PBS中連續(xù)稀釋，并調整到相同的最終顆粒計數（1.6×10^8顆粒），通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)確定，然后沉積在顯微鏡兼容的384孔玻璃板(Cellvis)上。樣品使用安裝在Ti Eclipse倒置顯微鏡（尼康）上的60倍油浸物鏡(NA=1.49)進行多次稀釋成像。使用相同的光照(100ms曝光時間)和聚焦（通過完美聚焦系統），每個樣本獲得多個圖像(200×200μm2)。為了提高信噪比，圖像使用連續(xù)四幀進行平均。分析圖像的EV密度為<1EV/10μm2，以避免粒子重疊，并在圖像中心裁剪65×65μm2區(qū)域，以減少小暈和不均勻光照的影響。EV被檢測為與顯微鏡的點擴散功能對應的顯微鏡的衍射限制物體，證實了單個囊泡的檢測。使用閾值圖像（>2倍背景強度）對峰值強度(ImageJ)進行粒子識別和量化。去除面積低于0.1μm2和面積高于10μm2的檢測斑點，以過濾掉噪聲和較大的聚集體。以未轉染的Expi293F細胞的EV樣本作為GFP熒光背景的陰性對照。

單分子GFP拷貝數的測定采用重組GFP作為參考熒光團。將rGFP以10倍的稀釋度(從1nM開始)添加到空孔中，并使用上述相同的設置對多次稀釋度進行成像。利用閾值圖像（>2倍背景強度）對單個熒光團的ImageJ1.52p進行識別和定量的峰值強度。隨后對單個熒光團進行時間分辨成像，通過記錄漂白痕跡來確認來自單個熒光團的信號。任何顯示出多步漂白痕跡的物體都被從分析中刪除。所得到的強度直方圖被用于估計單個熒光團的平均信號。同樣，用EV的強度直方圖來估計平均信號，通過直接除以熒光團的強度，可以估計出蛋白質的絕對拷貝數。由于與重組GFP樣品相比，EV樣品具有較高的異質性和低純度，在這次研究中三個GFP分子嚴格定義為SMLM的檢測限，以提供更穩(wěn)定的分析。

結果展示：

一、EV的分泌受到過表達特定的EV分選蛋白的影響
二、GFP載入EV的效率取決于EV的分選蛋白
三、單囊泡分析揭示了EV的異質性和將GFP裝載物納入工程化EV的不同亞群
四、在單分子水平上的單囊泡分析顯示，EV分選蛋白在促進GFP裝載到EV中的效率存在差異
結果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Silva, AM; Lázaro-Ibá?ez, E; Gunnarsson, A; et al.Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(10):e12130

發(fā)自小木蟲Android客戶端

回復此樓

» 猜你喜歡

新疆大學地質與礦業(yè)工程學院招生已經有32人回復
0856材料與化工353分求調劑已經有4人回復
282分材料專業(yè)求調劑院校已經有13人回復
315食品工程求調劑已經有5人回復
環(huán)境調劑已經有3人回復
接受26屆調劑生已經有20人回復
考研材料與化工，求調劑已經有3人回復
歡迎211本科同學，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠一本，交叉學科課題組已經有35人回復
304求調劑（085602一志愿985）已經有4人回復
294 英二數二物化求調劑已經有6人回復

» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼

1樓 2022-01-03 13:09:05

已閱回復此樓關注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

1551195

銀蟲 (著名寫手)

應助: 1 (幼兒園)
金幣: 413.9
帖子: 1006
在線: 27.2小時
蟲號: 28122963

外泌體純化，聯系15511958250

發(fā)自小木蟲IOS客戶端

贊一下

回復此樓

41樓2022-02-14 14:34:40

已閱回復此樓關注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

查看全部 53 個回答

簡單回復

KDME2樓

2022-01-03 13:09 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

鐵首星空3樓

2022-01-03 13:10 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

punlee4樓

2022-01-03 13:16 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

tzynew5樓

2022-01-03 13:16 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

冰山雪蓮燈6樓

2022-01-03 13:21 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

zhulei03247樓

2022-01-03 13:27 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

學員X0JicW8樓

2022-01-03 13:30 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

ai wei lai9樓

2022-01-03 13:46 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

好好先生year10樓

2022-01-03 13:52 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

秋土豆香11樓

2022-01-03 13:53 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

xyz2013041612樓

2022-01-03 14:04 回復

NanoFCMlxq(金幣+1): 謝謝參與

已獲得1個金幣發(fā)自小木蟲Android客戶端

我愛說德語13樓

2022-01-03 14:09 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

m_inter14樓

2022-01-03 14:23 回復

NanoFCMlxq(金幣+2): 謝謝參與

已獲得2個金幣發(fā)自小木蟲IOS客戶端

查看全部 53 個回答

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]		作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 環(huán)境調劑 +3	曉看天暮看云 2026-03-09	3/150	2026-03-10 00:34 by wdwdoo
[碩博家園] 2026級碩士研究生招生/調劑 +3	知足常樂的樂 2026-03-06	5/250	2026-03-09 20:56 by 木瓜膏
[考研] 0703化學調劑 +6	小奶蒼 2026-03-07	6/300	2026-03-09 20:50 by lsw010101
[考研] 材料與化工，291分，求調劑 +13	咕嚕咕嚕123123 2026-03-04	15/750	2026-03-09 09:32 by 30660438
[考研] 求調劑，一志愿江南大學，食品科學與工程，總分，320 +3	yyyyyukino 2026-03-07	3/150	2026-03-08 23:07 by 清風月
[考研] 求調劑 +3	拾柒12。 2026-03-08	3/150	2026-03-08 17:33 by bingxueer79
[考研] 347求調劑 +4	浮云滿足 2026-03-07	4/200	2026-03-08 16:46 by 星空星月
[考研] 招調劑 +20	帆船哥 2026-03-04	23/1150	2026-03-08 16:25 by taycat
[考研] 調劑的同學，走過路過，不要錯過 +10	likeihood 2026-03-06	15/750	2026-03-08 15:40 by 糾纏體
[考研] 一志愿211 化學305分求調劑 +3	0703楊悅305分 2026-03-05	3/150	2026-03-07 21:15 by yinhuanshun
[考研] 070300化學求調劑292分 +3	打烊eee 2026-03-07	3/150	2026-03-07 20:04 by houyaoxu
[考研] 一志愿哈爾濱工業(yè)大學0856材料與化工，前三科206，總分283，求調劑 +7	26考研求調劑 2026-03-06	7/350	2026-03-07 14:49 by Miko19
[考研] 一志愿南京大學資源與環(huán)境專業(yè)283分求調劑 +8	追云?? 2026-03-04	8/400	2026-03-07 09:23 by 斬魂滴兔子！
[考研] 求調劑推薦 +4	微辣不吃 2026-03-06	4/200	2026-03-07 00:28 by leaiy
[考研] 0703 東華大學理學化學均過 a 線，總分 281 求調劑 +6	香香 Lu 2026-03-03	11/550	2026-03-06 15:37 by @颯颯颯颯
[考研] 08工科求調劑 +3	隆LLL 2026-03-06	4/200	2026-03-06 15:26 by 隆LLL
[考研] 0856材料與化工求調劑！ +5	化工考生111 2026-03-04	11/550	2026-03-06 01:20 by 化工考生111
[考研] 材料與化工304求調劑 +7	邱gl 2026-03-05	10/500	2026-03-06 01:11 by 卷柏卷柏
[考研] 334求調劑 +6	Trying] 2026-03-05	8/400	2026-03-06 00:16 by wutongshun
[考研] 材料調劑 +4	L9370 2026-03-05	4/200	2026-03-05 19:36 by caszguilin

亭亭五月天在线观看,亭亭五月天在线观看,国产最新av一区二区,国产 高清 中文字幕,99re热久久亚洲综合精品成人,熟妇 一区二区三区,一级做a爰片性色毛片武则天,美女的骚穴视频播放,国产美女午夜免费视频

24小時熱門版塊排行榜

NanoFCMlxq

» 猜你喜歡

» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到: 查看全部散金貼

1551195

亭亭五月天在线观看,亭亭五月天在线观看,国产最新av一区二区,国产高清中文字幕,99re热久久亚洲综合精品成人,熟妇一区二区三区,一级做a爰片性色毛片武则天,美女的骚穴视频播放,国产美女午夜免费视频

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼