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外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（十一）: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機(jī)app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名為《Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution》[1]（在單囊泡和單分子水平定量評(píng)估裝載入工程化細(xì)胞外囊泡的蛋白含量）。

細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種幾乎所有細(xì)胞都會(huì)分泌的納米顆粒，分泌到細(xì)胞外或體液中，通過功能性生物分子的轉(zhuǎn)移傳遞細(xì)胞間通信。EV已被探索用于治療人類疾病的藥物分子的天然傳遞載體。事實(shí)上，EV作為細(xì)胞內(nèi)傳遞各種治療藥物的新候選藥物已經(jīng)顯示出了巨大的潛力，包括合成的小分子和生物分子，如RNA和大蛋白質(zhì)。此外，與合成遞送系統(tǒng)相比，這些囊泡有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：體積小、免疫原性低、缺乏細(xì)胞毒性、長(zhǎng)期安全性和易于通過多種策略裝載藥物。

可以用感興趣的分子工程化EV來(lái)修飾其裝載物組成。其中EV的蛋白修飾通常是通過細(xì)胞工程實(shí)現(xiàn)的，使用編碼和過表達(dá)目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒，這個(gè)目的蛋白是融合了腔內(nèi)或膜上參與EV自然發(fā)生發(fā)展的蛋白。為達(dá)到此目的選擇的EV蛋白通常在EV制劑中富集，有可能促進(jìn)裝載物高效率裝載進(jìn)入囊泡，在這里被稱為EV分選蛋白。常用的EV分選蛋白包括四酯蛋白（特別是CD63、CD9和CD81)、lamp2b和乳酸酯蛋白的C1C2結(jié)構(gòu)域。將所選擇的裝載物蛋白與EV分選蛋白融合是通過親代細(xì)胞工程將裝載物蛋白裝載到EV中最常見的策略。這種方法既允許在腔內(nèi)儲(chǔ)存定向輸送到靶細(xì)胞的裝載物，也可以在EV表面展示裝載物，通過與靶細(xì)胞表面受體的直接相互作用，增強(qiáng)其治療信號(hào)特性或靶向能力。據(jù)報(bào)道，已成功裝入EV的蛋白包括用于體外和體內(nèi)EV追蹤的熒光素酶和熒光蛋白、EV靶向的抗體和多肽、活性酶、用于同時(shí)裝載RNA的RNA結(jié)合蛋白和疫苗免疫原等。有趣的是，許多這些研究表明，裝載EV的蛋白的富集水平依賴于所使用的EV分選蛋白。然而，對(duì)不同EV分選蛋白的裝載效率的綜合比較仍僅限于少數(shù)候選蛋白，目前缺乏定量分析的工具。

細(xì)胞中有多種生物發(fā)生途徑導(dǎo)致EV的釋放，這解釋了細(xì)胞條件培養(yǎng)基中存在不同成分的囊泡群。即使用目前最專精的方法分離的原代或工程化EV仍具有異質(zhì)性，并包含具有不同組成的囊泡亞群。對(duì)EV的評(píng)估主要局限于大量蛋白質(zhì)含量分析的方法，如免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、EV結(jié)合珠子的常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)和質(zhì)譜，這些方法都不適合單囊泡表征。最近有幾種單囊泡分析的技術(shù)，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估蛋白裝載物，其中一些方法還達(dá)到單分子水平。其中包括透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)合免疫金標(biāo)記、原子力顯微鏡、超分辨率熒光顯微鏡、熒光相關(guān)光譜、納米流式檢測(cè)儀（NanoFCM）、成像流式細(xì)胞術(shù)、單粒子干涉反射率成像傳感（SP-IRIS）和激光鑷子拉曼光譜。重要的是，這些方法揭示了裝載物在原代和工程化EV亞群中的異質(zhì)分布，突出了在EV標(biāo)準(zhǔn)特征中對(duì)高分辨率技術(shù)的要求。

本研究旨在探索和驗(yàn)證在單囊泡和單分子水平上分析工程EV的技術(shù)，以快速和穩(wěn)定地評(píng)價(jià)不同EV分選蛋白在促進(jìn)蛋白裝載物方面的效率。Expi293F細(xì)胞被設(shè)計(jì)成分泌含有綠色熒光蛋白(GFP)的EV，該GFP與在EV中高度富集的選定的膜相關(guān)蛋白融合。使用免疫印跡技術(shù)（WB）批量分析小EV中的GFP水平，并與新型高分辨率單囊泡分析方法納米流式（NanoFCM）、ExoView和單分子定位顯微鏡(SMLM)進(jìn)行比較。我們的研究結(jié)果驗(yàn)證了使用NanoFCM N30設(shè)備和ExoView作為快速和可靠的工程EV單囊泡分析技術(shù)，捕獲了在EV亞群中的異質(zhì)性GFP分布。SMLM被證實(shí)是最準(zhǔn)確的方法，可以定量分析單個(gè)EV中裝載的GFP拷貝數(shù)。GFP富集水平的比較分析融合不同EV分類蛋白也顯示了新的適合將蛋白裝載物高效裝載進(jìn)入EV的候選蛋白，進(jìn)一步擴(kuò)大EV分類蛋白的范圍，可用于生成增強(qiáng)靶向目標(biāo)細(xì)胞能力和輸送功能化治療藥物的工程化EV。

研究過程：

一、EV分選蛋白的選擇和生物信息學(xué)特征

Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(kù)(Home - Extracellular vesicles database)、 ExoCarta(https://exocarta.org)和EVpedia(https://evpedia.info)查詢?nèi)祟怑V蛋白，并進(jìn)一步選擇小于50kDa的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的條目。通過文獻(xiàn)檢索，我們選擇了能夠耐受融合且不對(duì)EV生物發(fā)生產(chǎn)生負(fù)面影響的蛋白。EV蛋白和GFP序列從UniProt（條目ID：CD47：Q08722；SDCBP：O00560、APMAP：Q9HDC9、TSPAN14：Q8NG11、CD63：P08962、CD81：P60033、PDGFRβ：P09619；GFP：C5MKY7，攜帶V2A、F65L、S66L和H232L增強(qiáng)熒光），生成融合蛋白（蛋白序列見表S1）。融合蛋白的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由UniProt注釋和之前發(fā)表的關(guān)于EV分類蛋白的文獻(xiàn)來(lái)推測(cè)。

二、設(shè)計(jì)質(zhì)粒

利用人種蛋白表達(dá)的密碼子優(yōu)化，將GFP融合域和GFP融合蛋白序列反向翻譯成DNA序列。合成DNA插入物并克隆到pEBNAZ表達(dá)載體中的SacII和NotI位點(diǎn)，在CMV啟動(dòng)子控制下進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。所有的構(gòu)建物均通過GenScript進(jìn)行采購(gòu)。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

Expi293F懸浮細(xì)胞來(lái)源于293F人胚胎腎細(xì)胞，購(gòu)自ThermoFisher。細(xì)胞以0.5-1×10^6個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種，在化學(xué)限定、無(wú)血清、無(wú)蛋白的Expi293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至3-4×10^6個(gè)細(xì)胞/ml的密度，37?C，8%CO2(150rpm)。使用CedexHiRes分析儀（Roche）計(jì)數(shù)細(xì)胞和測(cè)量細(xì)胞活力。細(xì)胞一直使用到第21代。所有細(xì)胞均為支原體陰性，并經(jīng)短串聯(lián)重復(fù)序列DNA譜分析鑒定。

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行EV生產(chǎn)

將Expi293F細(xì)胞以3.9×10^6個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于45ml的Expi293表達(dá)培養(yǎng)基中，置于500ml的康寧錐形細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將質(zhì)粒DNA(75μg)在Expi293表達(dá)培養(yǎng)基中稀釋，并與40kDa鹽酸線性聚乙烯亞胺120μg/ml（(Polysciences）以1：1(v/v)的比例在Expi293表達(dá)培養(yǎng)基中混合。該混合物在室溫(RT)孵育15min，然后輕輕加入細(xì)胞。在相同條件下用無(wú)DNA的聚乙烯亞胺復(fù)合物處理的細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染的對(duì)照。24h后，在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入50ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞維持在37?C，8%CO2，150rpm。

五、細(xì)胞成像和流式細(xì)胞術(shù)分析

轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，對(duì)照和轉(zhuǎn)染的Expi293F細(xì)胞用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(VWR)固定，細(xì)胞核用Hoechst33342染色（ThermoFisher)。然后將細(xì)胞在PBS中重懸，轉(zhuǎn)移到96孔的細(xì)胞載體超板(PerkinElmer)中，短暫旋轉(zhuǎn)將細(xì)胞沉積到底部，并立即在旋轉(zhuǎn)圓盤共聚焦CV7000顯微鏡（Yokogawa）中使用40倍物鏡(NA0.75)和激光405nm(BP447/45nm)和488nm(BP522/35nm)進(jìn)行成像。每孔有6個(gè)視野成像，記錄每個(gè)位置。使用ImageJ1.52p軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理。使用配備BDFACSDiva軟件(BD Biosciences)流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞分析，在門中獲得10000個(gè)events。數(shù)據(jù)采用FlowJo v10.7.1軟件進(jìn)行分析。以非轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞的GFP背景熒光水平作為定義GFP+細(xì)胞群體的閾值。

六、EV分離

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液以300xg離心10min去除細(xì)胞，將澄清的上清液轉(zhuǎn)入新管中，2500xg離心30min，4?C，清除殘留的細(xì)胞碎片和凋亡小體。然后，將上清液轉(zhuǎn)移到94ml快速密封超離心管（Beckman Coulter）中，以20000xg離心25min，4?C，去除大EV。在OptimaXPN-80超離心機(jī)中使用了一個(gè)45Ti轉(zhuǎn)子（Beckman Coulter）。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，使用相同的轉(zhuǎn)子(k因子=210.4)在100000xg超離心2小時(shí)。用PBS再懸浮洗滌，再重復(fù)一次操作。EV在100-200μlPBS中重懸，并在?80?C下冷凍，以待下一步操作。

七、EV的透射電鏡觀察

EV懸浮液在2%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)PBS中固定30min。使用Bal-TecMED020涂層系統(tǒng)，碳涂層100網(wǎng)銅網(wǎng)格在7.2V下發(fā)光放電60秒，EV樣品立即在網(wǎng)格上孵育15min，4?C。然后用PBS洗滌網(wǎng)格，用1%戊二醛(Sigma-Aldrich)在4?C下固定5min，再次洗滌，用濾紙吸干。吸附在網(wǎng)格上的EV用2%醋酸鈾酰水溶液（Sigma-Aldrich）負(fù)染2min，然后使用FEITecnaiG2Spigirt號(hào)透射電子顯微鏡（ThermoFisher）清洗、干燥和分析。

八、EV的納米顆粒跟蹤分析

使用配備藍(lán)色激光(488nm，70mW)和CMOS相機(jī)(MM14c)的NanoSight LM14c分析尺寸分布和顆粒濃度。樣品用PBS稀釋從1000到8000倍，在所有條件下測(cè)量20-100個(gè)粒子/幀，以100 a.u. 的速度注射到測(cè)量室，每次測(cè)90s。數(shù)據(jù)采集的設(shè)備設(shè)置在測(cè)量之間保持不變，相機(jī)水平設(shè)置為15，自動(dòng)設(shè)置關(guān)閉，屏幕增益設(shè)置為1，閾值設(shè)置為7。數(shù)據(jù)分析采用NTA 3.2軟件(Malvern)進(jìn)行。

九、EV和細(xì)胞裂解物的蛋白印跡分析

轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞，用PBS洗滌，用PierceRIPA緩沖液，添加無(wú)EDTA蛋白酶抑制劑cocktail(Sigma-Aldrich)冰上裂解30min。裂解液在4?C下14000rpm離心10min，上清在?20?C下保存。用Qubit蛋白檢測(cè)試劑盒定量EV懸液和細(xì)胞裂解物的蛋白濃度。（省略步驟，常規(guī)WB操作）

十、EV免疫標(biāo)記及納米流式分析

EV(5×10^11顆粒/ml)用CellTrace遠(yuǎn)紅染料5μM標(biāo)記15min。然后，用裝有TLA-55轉(zhuǎn)子的臺(tái)式超離心機(jī)，用PBS超離心洗滌，去除多余的染料。

EV在納米流式N30儀器(NanoFCM)上進(jìn)行分析。EV樣品在分析前用PBS稀釋，以便在分析期間記錄2000-12000個(gè)顆粒數(shù)據(jù)。粒子信號(hào)采集采用10mW的藍(lán)色激光488nm/20mW紅色激光638nm，10%SS衰減，用1.0kPa的采樣壓力。采用單光子計(jì)數(shù)APD探測(cè)器的光散射和熒光采集方法，分別為側(cè)散射(SSC)FF01-488/24（觸發(fā)通道）、524/20和670/30帶通濾波片。以HPLC級(jí)水作為鞘液，將樣品流聚焦至～1.4μm。使用已知濃度的250nm二氧化硅納米球(用于EV濃度計(jì)算)，以及NanoFCM生產(chǎn)的含有68、91、113和155nm(用于EV尺寸計(jì)算)的納米球進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)量。PBS用于定義閾值。數(shù)據(jù)通過NanoFCM專業(yè)軟件v1.8軟件生成。使用PBS對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正，以未轉(zhuǎn)染Expi293F細(xì)胞的EV作為熒光陰性對(duì)照。

十一、用ExoView分析EV

將EV在溶液A(含有Tween-20的專有配方)中稀釋，將35μl樣品在ExoView四酯蛋白芯片(EV-TC-TTS-01)上RT孵育16小時(shí)，放置在密封的24孔板中。該芯片包被了cd63、cd81或cd9抗體，用于EV群體表征，或小鼠IgG1κ匹配同型抗體，用作非特異性EV結(jié)合的對(duì)照。然后在1ml溶液A中洗滌3次，3min，輕輕搖晃，然后用ExoView四酯酶標(biāo)記抗體混合(EV-TC-AB-01)在RT下孵育1小時(shí)，含有CF647偶聯(lián)抗cd63、抗cd81和抗cd9抗體和CF555偶聯(lián)抗GFP抗體，全部在BSA2%的A溶液中稀釋1：5000。然后在溶液A中清洗一次，在溶液B中清洗三次，然后用過濾過的去離子水沖洗并干燥。溶液A和溶液B提供了ExoView四酯蛋白芯片試劑盒(EV-TC-TTS-01)。然后，使用ExoScan2.5.5采集軟件，使用ExoViewR100對(duì)芯片進(jìn)行成像。使用ExoViewer2.5.0軟件對(duì)獲得的圖像進(jìn)行分析，EV尺寸閾值設(shè)置為50-200nm直徑。

十二、用單分子定位顯微鏡分析EV

轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的EV在PBS中連續(xù)稀釋，并調(diào)整到相同的最終顆粒計(jì)數(shù)（1.6×10^8顆粒），通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)確定，然后沉積在顯微鏡兼容的384孔玻璃板(Cellvis)上。樣品使用安裝在Ti Eclipse倒置顯微鏡（尼康）上的60倍油浸物鏡(NA=1.49)進(jìn)行多次稀釋成像。使用相同的光照(100ms曝光時(shí)間)和聚焦（通過完美聚焦系統(tǒng)），每個(gè)樣本獲得多個(gè)圖像(200×200μm2)。為了提高信噪比，圖像使用連續(xù)四幀進(jìn)行平均。分析圖像的EV密度為<1EV/10μm2，以避免粒子重疊，并在圖像中心裁剪65×65μm2區(qū)域，以減少小暈和不均勻光照的影響。EV被檢測(cè)為與顯微鏡的點(diǎn)擴(kuò)散功能對(duì)應(yīng)的顯微鏡的衍射限制物體，證實(shí)了單個(gè)囊泡的檢測(cè)。使用閾值圖像（>2倍背景強(qiáng)度）對(duì)峰值強(qiáng)度(ImageJ)進(jìn)行粒子識(shí)別和量化。去除面積低于0.1μm2和面積高于10μm2的檢測(cè)斑點(diǎn)，以過濾掉噪聲和較大的聚集體。以未轉(zhuǎn)染的Expi293F細(xì)胞的EV樣本作為GFP熒光背景的陰性對(duì)照。

單分子GFP拷貝數(shù)的測(cè)定采用重組GFP作為參考熒光團(tuán)。將rGFP以10倍的稀釋度(從1nM開始)添加到空孔中，并使用上述相同的設(shè)置對(duì)多次稀釋度進(jìn)行成像。利用閾值圖像（>2倍背景強(qiáng)度）對(duì)單個(gè)熒光團(tuán)的ImageJ1.52p進(jìn)行識(shí)別和定量的峰值強(qiáng)度。隨后對(duì)單個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行時(shí)間分辨成像，通過記錄漂白痕跡來(lái)確認(rèn)來(lái)自單個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)。任何顯示出多步漂白痕跡的物體都被從分析中刪除。所得到的強(qiáng)度直方圖被用于估計(jì)單個(gè)熒光團(tuán)的平均信號(hào)。同樣，用EV的強(qiáng)度直方圖來(lái)估計(jì)平均信號(hào)，通過直接除以熒光團(tuán)的強(qiáng)度，可以估計(jì)出蛋白質(zhì)的絕對(duì)拷貝數(shù)。由于與重組GFP樣品相比，EV樣品具有較高的異質(zhì)性和低純度，在這次研究中三個(gè)GFP分子嚴(yán)格定義為SMLM的檢測(cè)限，以提供更穩(wěn)定的分析。

結(jié)果展示：

一、EV的分泌受到過表達(dá)特定的EV分選蛋白的影響
二、GFP載入EV的效率取決于EV的分選蛋白
三、單囊泡分析揭示了EV的異質(zhì)性和將GFP裝載物納入工程化EV的不同亞群
四、在單分子水平上的單囊泡分析顯示，EV分選蛋白在促進(jìn)GFP裝載到EV中的效率存在差異
結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，或者私聊我要文獻(xiàn)資料，有理解得不對(duì)的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Silva, AM; Lázaro-Ibá?ez, E; Gunnarsson, A; et al.Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(10):e12130

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