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NanoFCMlxq

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今天分享一篇發(fā)表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名為《Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution》[1]（在單囊泡和單分子水平定量評估裝載入工程化細胞外囊泡的蛋白含量）。

細胞外囊泡(EVs)是一種幾乎所有細胞都會分泌的納米顆粒，分泌到細胞外或體液中，通過功能性生物分子的轉(zhuǎn)移傳遞細胞間通信。EV已被探索用于治療人類疾病的藥物分子的天然傳遞載體。事實上，EV作為細胞內(nèi)傳遞各種治療藥物的新候選藥物已經(jīng)顯示出了巨大的潛力，包括合成的小分子和生物分子，如RNA和大蛋白質(zhì)。此外，與合成遞送系統(tǒng)相比，這些囊泡有幾個優(yōu)點：體積小、免疫原性低、缺乏細胞毒性、長期安全性和易于通過多種策略裝載藥物。

可以用感興趣的分子工程化EV來修飾其裝載物組成。其中EV的蛋白修飾通常是通過細胞工程實現(xiàn)的，使用編碼和過表達目標蛋白的質(zhì)粒，這個目的蛋白是融合了腔內(nèi)或膜上參與EV自然發(fā)生發(fā)展的蛋白。為達到此目的選擇的EV蛋白通常在EV制劑中富集，有可能促進裝載物高效率裝載進入囊泡，在這里被稱為EV分選蛋白。常用的EV分選蛋白包括四酯蛋白（特別是CD63、CD9和CD81)、lamp2b和乳酸酯蛋白的C1C2結(jié)構(gòu)域。將所選擇的裝載物蛋白與EV分選蛋白融合是通過親代細胞工程將裝載物蛋白裝載到EV中最常見的策略。這種方法既允許在腔內(nèi)儲存定向輸送到靶細胞的裝載物，也可以在EV表面展示裝載物，通過與靶細胞表面受體的直接相互作用，增強其治療信號特性或靶向能力。據(jù)報道，已成功裝入EV的蛋白包括用于體外和體內(nèi)EV追蹤的熒光素酶和熒光蛋白、EV靶向的抗體和多肽、活性酶、用于同時裝載RNA的RNA結(jié)合蛋白和疫苗免疫原等。有趣的是，許多這些研究表明，裝載EV的蛋白的富集水平依賴于所使用的EV分選蛋白。然而，對不同EV分選蛋白的裝載效率的綜合比較仍僅限于少數(shù)候選蛋白，目前缺乏定量分析的工具。

細胞中有多種生物發(fā)生途徑導(dǎo)致EV的釋放，這解釋了細胞條件培養(yǎng)基中存在不同成分的囊泡群。即使用目前最專精的方法分離的原代或工程化EV仍具有異質(zhì)性，并包含具有不同組成的囊泡亞群。對EV的評估主要局限于大量蛋白質(zhì)含量分析的方法，如免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、EV結(jié)合珠子的常規(guī)流式細胞術(shù)和質(zhì)譜，這些方法都不適合單囊泡表征。最近有幾種單囊泡分析的技術(shù)，可以更準確地評估蛋白裝載物，其中一些方法還達到單分子水平。其中包括透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)合免疫金標記、原子力顯微鏡、超分辨率熒光顯微鏡、熒光相關(guān)光譜、納米流式檢測儀（NanoFCM）、成像流式細胞術(shù)、單粒子干涉反射率成像傳感（SP-IRIS）和激光鑷子拉曼光譜。重要的是，這些方法揭示了裝載物在原代和工程化EV亞群中的異質(zhì)分布，突出了在EV標準特征中對高分辨率技術(shù)的要求。

本研究旨在探索和驗證在單囊泡和單分子水平上分析工程EV的技術(shù)，以快速和穩(wěn)定地評價不同EV分選蛋白在促進蛋白裝載物方面的效率。Expi293F細胞被設(shè)計成分泌含有綠色熒光蛋白(GFP)的EV，該GFP與在EV中高度富集的選定的膜相關(guān)蛋白融合。使用免疫印跡技術(shù)（WB）批量分析小EV中的GFP水平，并與新型高分辨率單囊泡分析方法納米流式（NanoFCM）、ExoView和單分子定位顯微鏡(SMLM)進行比較。我們的研究結(jié)果驗證了使用NanoFCM N30設(shè)備和ExoView作為快速和可靠的工程EV單囊泡分析技術(shù)，捕獲了在EV亞群中的異質(zhì)性GFP分布。SMLM被證實是最準確的方法，可以定量分析單個EV中裝載的GFP拷貝數(shù)。GFP富集水平的比較分析融合不同EV分類蛋白也顯示了新的適合將蛋白裝載物高效裝載進入EV的候選蛋白，進一步擴大EV分類蛋白的范圍，可用于生成增強靶向目標細胞能力和輸送功能化治療藥物的工程化EV。

研究過程：

一、EV分選蛋白的選擇和生物信息學(xué)特征

Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(Home - Extracellular vesicles database)、 ExoCarta(https://exocarta.org)和EVpedia(https://evpedia.info)查詢?nèi)祟怑V蛋白，并進一步選擇小于50kDa的蛋白質(zhì)對應(yīng)的條目。通過文獻檢索，我們選擇了能夠耐受融合且不對EV生物發(fā)生產(chǎn)生負面影響的蛋白。EV蛋白和GFP序列從UniProt（條目ID：CD47：Q08722；SDCBP：O00560、APMAP：Q9HDC9、TSPAN14：Q8NG11、CD63：P08962、CD81：P60033、PDGFRβ：P09619；GFP：C5MKY7，攜帶V2A、F65L、S66L和H232L增強熒光），生成融合蛋白（蛋白序列見表S1）。融合蛋白的膜拓撲結(jié)構(gòu)由UniProt注釋和之前發(fā)表的關(guān)于EV分類蛋白的文獻來推測。

二、設(shè)計質(zhì)粒

利用人種蛋白表達的密碼子優(yōu)化，將GFP融合域和GFP融合蛋白序列反向翻譯成DNA序列。合成DNA插入物并克隆到pEBNAZ表達載體中的SacII和NotI位點，在CMV啟動子控制下進行重組蛋白表達。所有的構(gòu)建物均通過GenScript進行采購。

三、細胞培養(yǎng)

Expi293F懸浮細胞來源于293F人胚胎腎細胞，購自ThermoFisher。細胞以0.5-1×10^6個細胞/ml的密度接種，在化學(xué)限定、無血清、無蛋白的Expi293表達培養(yǎng)基中培養(yǎng)至3-4×10^6個細胞/ml的密度，37?C，8%CO2(150rpm)。使用CedexHiRes分析儀（Roche）計數(shù)細胞和測量細胞活力。細胞一直使用到第21代。所有細胞均為支原體陰性，并經(jīng)短串聯(lián)重復(fù)序列DNA譜分析鑒定。

四、細胞轉(zhuǎn)染進行EV生產(chǎn)

將Expi293F細胞以3.9×10^6個細胞/ml的密度接種于45ml的Expi293表達培養(yǎng)基中，置于500ml的康寧錐形細胞培養(yǎng)瓶中。將質(zhì)粒DNA(75μg)在Expi293表達培養(yǎng)基中稀釋，并與40kDa鹽酸線性聚乙烯亞胺120μg/ml（(Polysciences）以1：1(v/v)的比例在Expi293表達培養(yǎng)基中混合。該混合物在室溫(RT)孵育15min，然后輕輕加入細胞。在相同條件下用無DNA的聚乙烯亞胺復(fù)合物處理的細胞作為未轉(zhuǎn)染的對照。24h后，在每個細胞培養(yǎng)瓶中加入50ml新鮮培養(yǎng)基。細胞維持在37?C，8%CO2，150rpm。

五、細胞成像和流式細胞術(shù)分析

轉(zhuǎn)染48小時后，對照和轉(zhuǎn)染的Expi293F細胞用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(VWR)固定，細胞核用Hoechst33342染色（ThermoFisher)。然后將細胞在PBS中重懸，轉(zhuǎn)移到96孔的細胞載體超板(PerkinElmer)中，短暫旋轉(zhuǎn)將細胞沉積到底部，并立即在旋轉(zhuǎn)圓盤共聚焦CV7000顯微鏡（Yokogawa）中使用40倍物鏡(NA0.75)和激光405nm(BP447/45nm)和488nm(BP522/35nm)進行成像。每孔有6個視野成像，記錄每個位置。使用ImageJ1.52p軟件對圖像進行處理。使用配備BDFACSDiva軟件(BD Biosciences)流式細胞儀進行流式細胞分析，在門中獲得10000個events。數(shù)據(jù)采用FlowJo v10.7.1軟件進行分析。以非轉(zhuǎn)染對照細胞的GFP背景熒光水平作為定義GFP+細胞群體的閾值。

六、EV分離

細胞轉(zhuǎn)染48h后，將細胞培養(yǎng)上清液以300xg離心10min去除細胞，將澄清的上清液轉(zhuǎn)入新管中，2500xg離心30min，4?C，清除殘留的細胞碎片和凋亡小體。然后，將上清液轉(zhuǎn)移到94ml快速密封超離心管（Beckman Coulter）中，以20000xg離心25min，4?C，去除大EV。在OptimaXPN-80超離心機中使用了一個45Ti轉(zhuǎn)子（Beckman Coulter）。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，使用相同的轉(zhuǎn)子(k因子=210.4)在100000xg超離心2小時。用PBS再懸浮洗滌，再重復(fù)一次操作。EV在100-200μlPBS中重懸，并在?80?C下冷凍，以待下一步操作。

七、EV的透射電鏡觀察

EV懸浮液在2%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)PBS中固定30min。使用Bal-TecMED020涂層系統(tǒng)，碳涂層100網(wǎng)銅網(wǎng)格在7.2V下發(fā)光放電60秒，EV樣品立即在網(wǎng)格上孵育15min，4?C。然后用PBS洗滌網(wǎng)格，用1%戊二醛(Sigma-Aldrich)在4?C下固定5min，再次洗滌，用濾紙吸干。吸附在網(wǎng)格上的EV用2%醋酸鈾酰水溶液（Sigma-Aldrich）負染2min，然后使用FEITecnaiG2Spigirt號透射電子顯微鏡（ThermoFisher）清洗、干燥和分析。

八、EV的納米顆粒跟蹤分析

使用配備藍色激光(488nm，70mW)和CMOS相機(MM14c)的NanoSight LM14c分析尺寸分布和顆粒濃度。樣品用PBS稀釋從1000到8000倍，在所有條件下測量20-100個粒子/幀，以100 a.u. 的速度注射到測量室，每次測90s。數(shù)據(jù)采集的設(shè)備設(shè)置在測量之間保持不變，相機水平設(shè)置為15，自動設(shè)置關(guān)閉，屏幕增益設(shè)置為1，閾值設(shè)置為7。數(shù)據(jù)分析采用NTA 3.2軟件(Malvern)進行。

九、EV和細胞裂解物的蛋白印跡分析

轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞，用PBS洗滌，用PierceRIPA緩沖液，添加無EDTA蛋白酶抑制劑cocktail(Sigma-Aldrich)冰上裂解30min。裂解液在4?C下14000rpm離心10min，上清在?20?C下保存。用Qubit蛋白檢測試劑盒定量EV懸液和細胞裂解物的蛋白濃度。（省略步驟，常規(guī)WB操作）

十、EV免疫標記及納米流式分析

EV(5×10^11顆粒/ml)用CellTrace遠紅染料5μM標記15min。然后，用裝有TLA-55轉(zhuǎn)子的臺式超離心機，用PBS超離心洗滌，去除多余的染料。

EV在納米流式N30儀器(NanoFCM)上進行分析。EV樣品在分析前用PBS稀釋，以便在分析期間記錄2000-12000個顆粒數(shù)據(jù)。粒子信號采集采用10mW的藍色激光488nm/20mW紅色激光638nm，10%SS衰減，用1.0kPa的采樣壓力。采用單光子計數(shù)APD探測器的光散射和熒光采集方法，分別為側(cè)散射(SSC)FF01-488/24（觸發(fā)通道）、524/20和670/30帶通濾波片。以HPLC級水作為鞘液，將樣品流聚焦至～1.4μm。使用已知濃度的250nm二氧化硅納米球(用于EV濃度計算)，以及NanoFCM生產(chǎn)的含有68、91、113和155nm(用于EV尺寸計算)的納米球進行校準測量。PBS用于定義閾值。數(shù)據(jù)通過NanoFCM專業(yè)軟件v1.8軟件生成。使用PBS對所有數(shù)據(jù)進行背景校正，以未轉(zhuǎn)染Expi293F細胞的EV作為熒光陰性對照。

十一、用ExoView分析EV

將EV在溶液A(含有Tween-20的專有配方)中稀釋，將35μl樣品在ExoView四酯蛋白芯片(EV-TC-TTS-01)上RT孵育16小時，放置在密封的24孔板中。該芯片包被了cd63、cd81或cd9抗體，用于EV群體表征，或小鼠IgG1κ匹配同型抗體，用作非特異性EV結(jié)合的對照。然后在1ml溶液A中洗滌3次，3min，輕輕搖晃，然后用ExoView四酯酶標記抗體混合(EV-TC-AB-01)在RT下孵育1小時，含有CF647偶聯(lián)抗cd63、抗cd81和抗cd9抗體和CF555偶聯(lián)抗GFP抗體，全部在BSA2%的A溶液中稀釋1：5000。然后在溶液A中清洗一次，在溶液B中清洗三次，然后用過濾過的去離子水沖洗并干燥。溶液A和溶液B提供了ExoView四酯蛋白芯片試劑盒(EV-TC-TTS-01)。然后，使用ExoScan2.5.5采集軟件，使用ExoViewR100對芯片進行成像。使用ExoViewer2.5.0軟件對獲得的圖像進行分析，EV尺寸閾值設(shè)置為50-200nm直徑。

十二、用單分子定位顯微鏡分析EV

轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞的EV在PBS中連續(xù)稀釋，并調(diào)整到相同的最終顆粒計數(shù)（1.6×10^8顆粒），通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)確定，然后沉積在顯微鏡兼容的384孔玻璃板(Cellvis)上。樣品使用安裝在Ti Eclipse倒置顯微鏡（尼康）上的60倍油浸物鏡(NA=1.49)進行多次稀釋成像。使用相同的光照(100ms曝光時間)和聚焦（通過完美聚焦系統(tǒng)），每個樣本獲得多個圖像(200×200μm2)。為了提高信噪比，圖像使用連續(xù)四幀進行平均。分析圖像的EV密度為<1EV/10μm2，以避免粒子重疊，并在圖像中心裁剪65×65μm2區(qū)域，以減少小暈和不均勻光照的影響。EV被檢測為與顯微鏡的點擴散功能對應(yīng)的顯微鏡的衍射限制物體，證實了單個囊泡的檢測。使用閾值圖像（>2倍背景強度）對峰值強度(ImageJ)進行粒子識別和量化。去除面積低于0.1μm2和面積高于10μm2的檢測斑點，以過濾掉噪聲和較大的聚集體。以未轉(zhuǎn)染的Expi293F細胞的EV樣本作為GFP熒光背景的陰性對照。

單分子GFP拷貝數(shù)的測定采用重組GFP作為參考熒光團。將rGFP以10倍的稀釋度(從1nM開始)添加到空孔中，并使用上述相同的設(shè)置對多次稀釋度進行成像。利用閾值圖像（>2倍背景強度）對單個熒光團的ImageJ1.52p進行識別和定量的峰值強度。隨后對單個熒光團進行時間分辨成像，通過記錄漂白痕跡來確認來自單個熒光團的信號。任何顯示出多步漂白痕跡的物體都被從分析中刪除。所得到的強度直方圖被用于估計單個熒光團的平均信號。同樣，用EV的強度直方圖來估計平均信號，通過直接除以熒光團的強度，可以估計出蛋白質(zhì)的絕對拷貝數(shù)。由于與重組GFP樣品相比，EV樣品具有較高的異質(zhì)性和低純度，在這次研究中三個GFP分子嚴格定義為SMLM的檢測限，以提供更穩(wěn)定的分析。

結(jié)果展示：

一、EV的分泌受到過表達特定的EV分選蛋白的影響
二、GFP載入EV的效率取決于EV的分選蛋白
三、單囊泡分析揭示了EV的異質(zhì)性和將GFP裝載物納入工程化EV的不同亞群
四、在單分子水平上的單囊泡分析顯示，EV分選蛋白在促進GFP裝載到EV中的效率存在差異
結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Silva, AM; Lázaro-Ibá?ez, E; Gunnarsson, A; et al.Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(10):e12130

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