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pyyfm

木蟲 (小有名氣)

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[交流] 黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)-體外降高尿酸實(shí)驗(yàn)

我做了一個(gè)體外降高尿酸實(shí)驗(yàn)，用了2種實(shí)驗(yàn)方法：
1.XOD 抑制活性測試
反應(yīng)體系體積為 200 μL，依次向 96 孔板中加入樣品 40 μL， 20 U/L 的 XOD
溶液 80 μL，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 40℃ 孵育 30 min，之后加入 500 μmol/L 底物黃嘌
呤溶液 80 μL，放入 40℃ 恒溫培養(yǎng)箱中孵育 15 min，然后在 292 nm 處記錄吸光
度值。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置有樣品組（含樣品、酶及底物）、空白組（含底物和樣品，
不含酶）、陽性對照組（含別嘌呤醇、酶及底物）、酶組（含酶和底物，不加樣品），
各個(gè)組均含 3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，各樣品終濃度為 100 μg/ m L，XOD 抑制
率計(jì)算公式為：抑制率（%）=[1-（樣品 OD 值-空白 OD 值）/（酶 OD 值-空白
OD 值）]×100%。
這個(gè)方法獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)抑制率（%）大于100%。樣品與陽性藥物的抑制率在高濃度下大于100%

2 NBT法
空白組XOD活性的測定:吸取50mmol·L－1磷酸緩沖液3mL加入至10mL容量瓶中，加入3mL黃嘌呤溶液(2.0mmol·L－1)和0.4mL氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT，1.8mg·L－1)，搖勻，即得XOD活性測定空白溶液。向該空白溶液中加入2.5mL黃嘌呤氧化酶溶液(0.08U·mL－1)，搖勻，得到XOD活性測定溶液，以酶加入時(shí)間開始計(jì)時(shí)，于25℃反應(yīng)30min后采用752型紫外光柵分光光度計(jì)測其560nm下的吸光度值(A0)。樣品對XOD抑制活性測定:精密吸取陽性對照藥別嘌呤醇(allopurinol)、樣品溶液0.5mL，分別置于10mL容量瓶中，按空白組的操作分別加入緩沖液、黃嘌呤溶液和NBT，以酶加入時(shí)間開始計(jì)時(shí)，相同反應(yīng)條件下，測得各樣品的吸光度值(Ax)，根據(jù)公式:抑制率(%)=(A0－Ax)/A0×100%計(jì)算各化合物對XOD的抑制率。

這種方法存在的問題：不同濃度樣品與陽性對照的抑制率不存在梯度，而且抑制率很接近。且陽性藥物（別嘌呤醇）在12.5μM的濃度下抑制率只有20%。2種都是相同樣品進(jìn)行測試，得到的抑制率也都不一樣。

想請教群里朋友們在做體外XOD 抑制活性測試的時(shí)候是否有遇到我一樣的情況？

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1樓 2021-10-13 11:55:53

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zhaocl_jq

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請教一下樓主，第一種方法XOD溶液用什么溶劑？

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7樓2021-10-23 14:58:54

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zhangdigua

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9樓2021-10-23 19:15:32

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何丶sir

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你好，你的nbt法會不會生成藍(lán)黑色沉淀，然后直接搖勻?qū)氡壬笾忻矗?br />
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15樓2022-04-13 16:29:32

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dai97

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我倒是沒有遇到apl組抑制率不成梯度。但是，我最近做的酶反應(yīng)組反應(yīng)速度很低，

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16樓2022-07-04 09:37:33

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renbeibei

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請問樓主抑制劑濃度增大，吸光度會變大還是變小啊

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18樓2022-07-12 20:39:13

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做一個(gè)不同時(shí)間的動力學(xué)測試看看

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19樓2024-01-25 14:02:33

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魔弈

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pyyfm(金幣+1): 謝謝參與

遇到同樣問題，樓主解決問題了嗎？

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20樓2024-12-16 15:02:46

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miaojiabing2樓

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xiaoqiuqiu204樓

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