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黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)-體外降高尿酸實(shí)驗(yàn)
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我做了一個(gè)體外降高尿酸實(shí)驗(yàn)，用了2種實(shí)驗(yàn)方法： 1.XOD 抑制活性測(cè)試 反應(yīng)體系體積為 200 μL，依次向 96 孔板中加入樣品 40 μL， 20 U/L 的 XOD 溶液 80 μL，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 40℃ 孵育 30 min，之后加入 500 μmol/L 底物黃嘌 呤溶液 80 μL，放入 40℃ 恒溫培養(yǎng)箱中孵育 15 min，然后在 292 nm 處記錄吸光 度值。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置有樣品組（含樣品、酶及底物）、空白組（含底物和樣品， 不含酶）、陽(yáng)性對(duì)照組（含別嘌呤醇、酶及底物）、酶組（含酶和底物，不加樣品）， 各個(gè)組均含 3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，各樣品終濃度為 100 μg/ m L，XOD 抑制 率計(jì)算公式為：抑制率（%）=[1-（樣品 OD 值-空白 OD 值）/（酶 OD 值-空白 OD 值）]×100%。 這個(gè)方法獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)抑制率（%）大于100%。樣品與陽(yáng)性藥物的抑制率在高濃度下大于100% 2 NBT法 空白組XOD活性的測(cè)定:吸取50mmol·L－1磷酸緩沖液3mL加入至10mL容量瓶中，加入3mL黃嘌呤溶液(2.0mmol·L－1)和0.4mL氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT，1.8mg·L－1)，搖勻，即得XOD活性測(cè)定空白溶液。向該空白溶液中加入2.5mL黃嘌呤氧化酶溶液(0.08U·mL－1)，搖勻，得到XOD活性測(cè)定溶液，以酶加入時(shí)間開(kāi)始計(jì)時(shí)，于25℃反應(yīng)30min后采用752型紫外光柵分光光度計(jì)測(cè)其560nm下的吸光度值(A0)。樣品對(duì)XOD抑制活性測(cè)定:精密吸取陽(yáng)性對(duì)照藥別嘌呤醇(allopurinol)、樣品溶液0.5mL，分別置于10mL容量瓶中，按空白組的操作分別加入緩沖液、黃嘌呤溶液和NBT，以酶加入時(shí)間開(kāi)始計(jì)時(shí)，相同反應(yīng)條件下，測(cè)得各樣品的吸光度值(Ax)，根據(jù)公式:抑制率(%)=(A0－Ax)/A0×100%計(jì)算各化合物對(duì)XOD的抑制率。 這種方法存在的問(wèn)題：不同濃度樣品與陽(yáng)性對(duì)照的抑制率不存在梯度，而且抑制率很接近。且陽(yáng)性藥物（別嘌呤醇）在12.5μM的濃度下抑制率只有20%。2種都是相同樣品進(jìn)行測(cè)試，得到的抑制率也都不一樣。 想請(qǐng)教群里朋友們?cè)谧鲶w外XOD 抑制活性測(cè)試的時(shí)候是否有遇到我一樣的情況？ |
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nono20093樓
2021-10-13 21:54
回復(fù)
pyyfm(金幣+1): 謝謝參與
。 發(fā)自小木蟲Android客戶端
bjdxyxy8樓
2021-10-23 18:15
回復(fù)
pyyfm(金幣+1): 謝謝參與
。 發(fā)自小木蟲Android客戶端
bjdxyxy10樓
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bjdxyxy11樓
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