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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 層析/純化 » 被DEAE FF折磨吐了
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被DEAE FF折磨吐了 已有1人參與
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請教各位前輩，我目前要純化一種蛋白，無標簽，約60KD，PI5.1 實驗步驟如下： 樣品處理： 1.組織溶于等體積標準鹽溶液（含100mM Kcl）樣品洗滌超聲離心棄上清取沉淀，重復3次 2.沉淀復懸于5倍體積提取液（含500mmNacl）超聲離心棄上清取沉淀，重復2次 3.沉淀復懸于Buffer A（10mM 磷酸二氫鈉），超聲后過濾膜得上柱樣品 柱子為DEAE FF 1ml 平衡和洗脫緩Buffer均為磷酸二氫鈉（含8M尿素），分別為10mM和1000mM,PH均為7.0 上柱前曾用BufferA(10mM)平衡20個柱體積至基線平穩(wěn)，上樣量為10ml 洗脫方式為梯度濃度洗脫，以2ml/min，10ml一管收集；梯度濃度設置如下 NO 時間 A% B% 1 0 100 0 2 30 90 10 3 90 85 15 4 150 80 20 5 240 60 40 6 300 50 50 7 360 30 70 8 390 0 100 因實驗室沒有電導儀，所以沒有測過電導 出現(xiàn)的問題： 按梯度濃度收集80管樣品，總是在第一管出現(xiàn)目的蛋白和一些雜蛋白，后續(xù)管里無任何蛋白。嘗試過改變PH為6.5，7.5，8.0，結果依然如此。請教各位前輩這是沒掛上柱子嗎？在不換柱子得情況下有哪些可以改進的地方？ |
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