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gxmpcc新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
被DEAE FF折磨吐了 已有1人參與
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請(qǐng)教各位前輩，我目前要純化一種蛋白，無(wú)標(biāo)簽，約60KD，PI5.1 實(shí)驗(yàn)步驟如下： 樣品處理： 1.組織溶于等體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（含100mM Kcl）樣品洗滌超聲離心棄上清取沉淀，重復(fù)3次 2.沉淀復(fù)懸于5倍體積提取液（含500mmNacl）超聲離心棄上清取沉淀，重復(fù)2次 3.沉淀復(fù)懸于Buffer A（10mM 磷酸二氫鈉），超聲后過(guò)濾膜得上柱樣品 柱子為DEAE FF 1ml 平衡和洗脫緩Buffer均為磷酸二氫鈉（含8M尿素），分別為10mM和1000mM,PH均為7.0 上柱前曾用BufferA(10mM)平衡20個(gè)柱體積至基線平穩(wěn)，上樣量為10ml 洗脫方式為梯度濃度洗脫，以2ml/min，10ml一管收集；梯度濃度設(shè)置如下 NO 時(shí)間 A% B% 1 0 100 0 2 30 90 10 3 90 85 15 4 150 80 20 5 240 60 40 6 300 50 50 7 360 30 70 8 390 0 100 因?qū)嶒?yàn)室沒(méi)有電導(dǎo)儀，所以沒(méi)有測(cè)過(guò)電導(dǎo) 出現(xiàn)的問(wèn)題： 按梯度濃度收集80管樣品，總是在第一管出現(xiàn)目的蛋白和一些雜蛋白，后續(xù)管里無(wú)任何蛋白。嘗試過(guò)改變PH為6.5，7.5，8.0，結(jié)果依然如此。請(qǐng)教各位前輩這是沒(méi)掛上柱子嗎？在不換柱子得情況下有哪些可以改進(jìn)的地方？ |
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既然你溶解樣品沒(méi)用尿素，你的純化緩沖為啥要用尿素？變性后的等電點(diǎn)和理論等電點(diǎn)是不一樣的。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
2樓2021-07-16 09:19:24
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3樓2021-07-16 15:03:26
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4樓2021-08-03 10:34:35
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5樓2023-03-05 09:25:13
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你好，請(qǐng)問(wèn)為什么我過(guò)這個(gè)柱子出現(xiàn)蛋白在不同濃度梯度下被重復(fù)洗脫 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
6樓2023-03-27 22:27:22
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