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lostunit新蟲 (小有名氣)
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表達的蛋白質用tev酶切割后，目標蛋白無法與原蛋白分離
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我的蛋白在表達后需要用tev酶切除His標簽，可是切完后總是切不完，而且切下來的目標蛋白好像會和原蛋白有相互作用，無法再用Ni-NTA分離(切下來的目標蛋白已經(jīng)沒有了his標簽，卻無法從鎳柱上洗脫下來，之后用凝膠層析也無法將原蛋白和切下來的蛋白分離，SDSPAGE顯示兩種蛋白在同一個峰里)。 現(xiàn)在我考慮的是兩種方法: 1. 提高tev酶的活性，將原蛋白盡量全部酶切，只剩下目標蛋白和切下來的his標簽，這樣就能分離出目標蛋白。但嘗試很多條件都無法達到，總是剩下大概一半的蛋白切不動。 2. 添加一些試劑破壞原蛋白和目標蛋白的相互作用。我的蛋白里有很多二硫鍵，所以試過GSH和GSSG，但沒有用。 大家有沒有什么好方法呢？ @飛約瘋人院 @wizardfan @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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2樓2021-01-25 22:30:54
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1. Cys多，形成分子間聚集體。驗證：還原非還原電泳，一份樣品Loading Buffer加還原劑，另一方樣品不加，電泳比較是否形成二硫鍵聚集體。是的話加還原劑，如β-ME，DTT，TCEP，加之前確認一下填料對不同還原劑的耐受量，不同填料差異是比較大的。 2. Cys的巰基也是可以和Ni填料結合的，但作用力弱于His，如果有多個Cys，His或其它能結合的氨基酸側鏈在空間上比較接近，就容易結合填料，一般的處理方法是加低濃度的咪唑來競爭結合。Cys多的話，還原劑也加上。 3. 不知道你用的是哪種Ni填料，但通常使用的多是羧酸類配基的填料，也就會存在一定的離子相互作用，Ni填料的使用一般要求鹽濃度最好在300mM NaCl以上，可以降低蛋白與填料間，以及蛋白分子間的靜電吸引力。對于帶異種電荷殘基比較多的蛋白，鹽濃度最好再高點。 4. 酶切切不完全，如果酶本身沒有問題，酶切體系也沒問題，那么就是蛋白的問題，多半是蛋白的酶切位點沒有較好地暴露出來。如果不考慮酶切位點被部分折疊進了蛋白內部的情況，多半是蛋白分子間形成了可溶性聚集體，導致部分位于聚集體表層的蛋白的酶切位點可以被識別，而在聚集體內部的酶切位點無法暴露切割�？赡苁窃颍喝绻鞘杷饔弥鲗У木奂蟾怕蕰纬筛蟮陌w沉淀，所以我個人更傾向于認為是二硫鍵錯配交聯(lián)或二硫鍵錯配與靜電吸引力共同主導的聚集。如果是前者，在酶切時還是加足夠的還原劑，如果是后者就需要補加足夠的鹽（但TEV的酶活受鹽濃度影響）。如果是我，我會把TEV酶切位點改掉，比如換成更好用的3C位點或者sumo標簽。萬一疏水作用比較明顯，可以加低濃度的尿素或鹽酸胍來競爭氫鍵。 |
10樓2021-01-28 15:01:32
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