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lostunit新蟲(chóng) (小有名氣)
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表達(dá)的蛋白質(zhì)用tev酶切割后，目標(biāo)蛋白無(wú)法與原蛋白分離
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我的蛋白在表達(dá)后需要用tev酶切除His標(biāo)簽，可是切完后總是切不完，而且切下來(lái)的目標(biāo)蛋白好像會(huì)和原蛋白有相互作用，無(wú)法再用Ni-NTA分離(切下來(lái)的目標(biāo)蛋白已經(jīng)沒(méi)有了his標(biāo)簽，卻無(wú)法從鎳柱上洗脫下來(lái)，之后用凝膠層析也無(wú)法將原蛋白和切下來(lái)的蛋白分離，SDSPAGE顯示兩種蛋白在同一個(gè)峰里)。 現(xiàn)在我考慮的是兩種方法: 1. 提高tev酶的活性，將原蛋白盡量全部酶切，只剩下目標(biāo)蛋白和切下來(lái)的his標(biāo)簽，這樣就能分離出目標(biāo)蛋白。但嘗試很多條件都無(wú)法達(dá)到，總是剩下大概一半的蛋白切不動(dòng)。 2. 添加一些試劑破壞原蛋白和目標(biāo)蛋白的相互作用。我的蛋白里有很多二硫鍵，所以試過(guò)GSH和GSSG，但沒(méi)有用。 大家有沒(méi)有什么好方法呢？ @飛約瘋?cè)嗽?/u> @wizardfan @biostar2009 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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1. Cys多，形成分子間聚集體。驗(yàn)證：還原非還原電泳，一份樣品Loading Buffer加還原劑，另一方樣品不加，電泳比較是否形成二硫鍵聚集體。是的話加還原劑，如β-ME，DTT，TCEP，加之前確認(rèn)一下填料對(duì)不同還原劑的耐受量，不同填料差異是比較大的。 2. Cys的巰基也是可以和Ni填料結(jié)合的，但作用力弱于His，如果有多個(gè)Cys，His或其它能結(jié)合的氨基酸側(cè)鏈在空間上比較接近，就容易結(jié)合填料，一般的處理方法是加低濃度的咪唑來(lái)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。Cys多的話，還原劑也加上。 3. 不知道你用的是哪種Ni填料，但通常使用的多是羧酸類配基的填料，也就會(huì)存在一定的離子相互作用，Ni填料的使用一般要求鹽濃度最好在300mM NaCl以上，可以降低蛋白與填料間，以及蛋白分子間的靜電吸引力。對(duì)于帶異種電荷殘基比較多的蛋白，鹽濃度最好再高點(diǎn)。 4. 酶切切不完全，如果酶本身沒(méi)有問(wèn)題，酶切體系也沒(méi)問(wèn)題，那么就是蛋白的問(wèn)題，多半是蛋白的酶切位點(diǎn)沒(méi)有較好地暴露出來(lái)。如果不考慮酶切位點(diǎn)被部分折疊進(jìn)了蛋白內(nèi)部的情況，多半是蛋白分子間形成了可溶性聚集體，導(dǎo)致部分位于聚集體表層的蛋白的酶切位點(diǎn)可以被識(shí)別，而在聚集體內(nèi)部的酶切位點(diǎn)無(wú)法暴露切割�？赡苁窃颍喝绻鞘杷饔弥鲗�(dǎo)的聚集，大概率會(huì)形成更大的包涵體沉淀，所以我個(gè)人更傾向于認(rèn)為是二硫鍵錯(cuò)配交聯(lián)或二硫鍵錯(cuò)配與靜電吸引力共同主導(dǎo)的聚集。如果是前者，在酶切時(shí)還是加足夠的還原劑，如果是后者就需要補(bǔ)加足夠的鹽（但TEV的酶活受鹽濃度影響）。如果是我，我會(huì)把TEV酶切位點(diǎn)改掉，比如換成更好用的3C位點(diǎn)或者sumo標(biāo)簽。萬(wàn)一疏水作用比較明顯，可以加低濃度的尿素或鹽酸胍來(lái)競(jìng)爭(zhēng)氫鍵。 |
10樓2021-01-28 15:01:32
2樓2021-01-25 22:30:54
snoopyzxx
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3樓2021-01-26 07:24:28
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4樓2021-01-26 07:25:37
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