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飛不動(dòng)D鳥(niǎo)新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
質(zhì)粒pYES2轉(zhuǎn)化酵母沒(méi)有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)
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各位前輩： 我最近在做酵母的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，用到兩個(gè)質(zhì)粒一個(gè)是cas9質(zhì)粒一個(gè)是pYES2質(zhì)粒，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，具體方法如下： 1. 挑取單克隆酵母BY4741于10 ml YPD培養(yǎng)基中，30℃，250 rpm過(guò)夜培養(yǎng)。 2. 測(cè)定過(guò)夜培養(yǎng)之后的OD600，轉(zhuǎn)接于50 ml YPD培養(yǎng)基中，使初始OD600=0.4，細(xì)胞數(shù)目約為5×106 。繼續(xù)培養(yǎng)2-4 h，使OD600=1.3-1.5，細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2×107。 3. 用50 ml 離心管，2500 rpm，5 min 離心，收集菌體，在40 ml 1×TE懸浮。 4. 2500 rpm，5 min 離心，去上清，收集菌體重懸于2 ml 1×LiAc/0.5 TE 中。 5. 在室溫下靜置10 min。 6. 然后依次加入1 μg的質(zhì)粒，100 μl的酵母懸液，700 μl 1×LiAc/40%PEG3350/1×TE，劇烈振蕩1 min 。在30℃情況下孵育30 min。 7. 加入88 μl DMSO，混勻，在42℃下熱激7min（或20 min-25 min） 8. 2500 rpm ，5 min 離心，去除上清，在200 μl 1× TE中重懸。 9. 涂布于選擇培養(yǎng)基含有G418的培養(yǎng)基（G418濃度：200 μg/ml） 10. 將平板在30 ℃培養(yǎng)2-3天。 可是連著做了幾次了平板上都沒(méi)有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，想問(wèn)下大家問(wèn)題出在哪里了，或者有什么可以改進(jìn)的地方嗎. |
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菌株確定沒(méi)問(wèn)題吧，轉(zhuǎn)化平板沒(méi)問(wèn)題吧 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
3樓2020-09-12 00:08:04
飛不動(dòng)D鳥(niǎo)
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菌株沒(méi)問(wèn)題的吧，篩選培養(yǎng)基用的SD-Ura,加了2%的葡萄糖溶液。就是篩不出來(lái) 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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nono20095樓
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2020-09-14 08:17
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