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absinbio
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Western Blot進階技巧第一彈——從了解目的蛋白開始 已有4人參與
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蛋白質(zhì)印跡 (Western Blot)，相信大家對此都不陌生，做為檢測蛋白表達及半定量的基礎(chǔ)實驗方法，也是很多小伙伴們初入實驗室的第一門課。 “上手容易，精通難”可謂對WB實驗的最佳注釋，初入實驗室的“菜鳥”可以很快上手，做出漂亮的條帶，做過多年的“大神”也可能一著不慎，實驗“翻車”，結(jié)果一塌糊涂。有些實驗室甚至流傳著一些所謂的“玄學”，新手人品好，難做的條帶給新手做等等。 真的是這樣么？實驗技術(shù)可不是拼人品，靠運氣的事兒，接下來小編將會為大家?guī)鞼B進階技巧系列，干貨滿滿，讓大家提升WB實驗技巧，成為真正的實驗“大神”。 首先，讓我們了解一下什么是WB實驗吧： ▲【定義】WB又稱為免疫印跡 (immune blot) ，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合半定量的檢測樣品中的某種蛋白的方法。 ▲【原理】通過凝膠電泳，將不同分子量大小的蛋白質(zhì)分離開，再利用特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。 ▲【應用】定性檢測：目標蛋白有無，分子量大�。欢繖z測：檢測目標蛋白含量（半定量）。 圖1. WB操作流程圖 看到這，相信之前對WB了解不多的同學也應該對WB有了一個基礎(chǔ)的認識。那么，怎樣可以把這看似簡單的幾步做好，拿到漂亮的實驗結(jié)果呢？話不多說，上干貨。 小編首先要強調(diào)的一點，就是了解目的蛋白，這也是今天這篇文章主要給大家分享的內(nèi)容。可能有的小伙伴會有疑問，為什么要講一個跟WB操作沒關(guān)系的步驟呢？說好的WB進階呢？其實，這往往是很多新手忽視的關(guān)鍵點，對目的蛋白一知半解，是沒有辦法做好WB實驗的，其他免疫學實驗也是一樣，可能有的小伙伴還不是特別相信，接下來讓小編帶大家看看為什么了解目的蛋白是如此的重要吧~ 了解目的蛋白對整個WB 實驗的重要性： 1.了解目的蛋白，才知道目的蛋白在實驗樣品中是否有表達 WB實驗檢測，很多小伙伴會遇到的問題之一就是無條帶，也就是陰性結(jié)果，如何判斷陰性結(jié)果是實驗操作問題造成的“假陰性”還是本該如此的“真陰性”，這就需要大家在實驗前，就對目的蛋白有一個清晰的認識。很多蛋白的表達是有組織特異性的，例如IL-10R，在視網(wǎng)膜，脾臟和肺腺癌組織中有高表達，其他組織表達含量較低；還有一些蛋白，則需要特定的刺激條件才會高表達，這種情況往往在磷酸化蛋白及炎癥因子蛋白等中較為常見，如果未做特殊的處理，目的蛋白表達含量很低，無法被WB檢測出。 2.了解目的蛋白，才知道如何制備樣本 樣本制備也是WB的關(guān)鍵步驟，后續(xù)的文章中也會為大家詳細分析。如何選擇合適的樣本制備方法，關(guān)鍵因素就是要了解目的蛋白；除了上面第一步中的要了解目的蛋白表達組織，及預處理條件外，還需確認目的蛋白表達的亞細胞定位，例如，細胞膜蛋白，核蛋白，線粒體蛋白和胞漿蛋白的提取方式都不一樣，選擇合適的方式，才能制備合格的樣品，方便后續(xù)的WB實驗。另外一個需要注意的因素就是需要加入對應的蛋白酶抑制劑，這一點對于磷酸化的蛋白尤為重要，否則蛋白在提取過程中就被降解，會造成“假陰性”結(jié)果。 3. 了解目的蛋白，才知道如何選擇內(nèi)參 內(nèi)參抗體，是WB實驗中的重要參考，WB可以對目的蛋白進行半定量分析，判斷不同樣品中目的蛋白表達含量的多少，就是取決于內(nèi)參的標定。內(nèi)參選擇在WB實驗中是很關(guān)鍵的因素，可不是GAPDH或者β-actin萬用的哦。內(nèi)參如何選擇，最重要的決定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表達位置及預處理條件。小編在這里總結(jié)了一下內(nèi)參的選擇表，大家可以保存哦~ 好了，相信大家應該知道實驗前了解目的蛋白的重要性了吧，如何了解目的蛋白呢？可以通過UniProt網(wǎng)站搜尋蛋白的相關(guān)信息，也可以在Pubmed上查閱對應的研究文獻，相信聰明的小伙伴們肯定可以做好的，今天的分享就先到這，接下來我們還會分享整個WB操作過程中的細節(jié)，如果您也有實驗心得想分享給大家，歡迎投稿！ |
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3樓2020-08-14 08:42:48
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