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absinbio
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Western Blot進(jìn)階技巧第一彈——從了解目的蛋白開始 已有4人參與
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蛋白質(zhì)印跡 (Western Blot)，相信大家對(duì)此都不陌生，做為檢測(cè)蛋白表達(dá)及半定量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法，也是很多小伙伴們初入實(shí)驗(yàn)室的第一門課。 “上手容易，精通難”可謂對(duì)WB實(shí)驗(yàn)的最佳注釋，初入實(shí)驗(yàn)室的“菜鳥”可以很快上手，做出漂亮的條帶，做過(guò)多年的“大神”也可能一著不慎，實(shí)驗(yàn)“翻車”，結(jié)果一塌糊涂。有些實(shí)驗(yàn)室甚至流傳著一些所謂的“玄學(xué)”，新手人品好，難做的條帶給新手做等等。 真的是這樣么？實(shí)驗(yàn)技術(shù)可不是拼人品，靠運(yùn)氣的事兒，接下來(lái)小編將會(huì)為大家?guī)?lái)WB進(jìn)階技巧系列，干貨滿滿，讓大家提升WB實(shí)驗(yàn)技巧，成為真正的實(shí)驗(yàn)“大神”。 首先，讓我們了解一下什么是WB實(shí)驗(yàn)吧： ▲【定義】WB又稱為免疫印跡 (immune blot) ，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合半定量的檢測(cè)樣品中的某種蛋白的方法。 ▲【原理】通過(guò)凝膠電泳，將不同分子量大小的蛋白質(zhì)分離開，再利用特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。 ▲【應(yīng)用】定性檢測(cè)：目標(biāo)蛋白有無(wú)，分子量大小；定量檢測(cè)：檢測(cè)目標(biāo)蛋白含量（半定量）。 圖1. WB操作流程圖 看到這，相信之前對(duì)WB了解不多的同學(xué)也應(yīng)該對(duì)WB有了一個(gè)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)。那么，怎樣可以把這看似簡(jiǎn)單的幾步做好，拿到漂亮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢？話不多說(shuō)，上干貨。 小編首先要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)，就是了解目的蛋白，這也是今天這篇文章主要給大家分享的內(nèi)容。可能有的小伙伴會(huì)有疑問(wèn)，為什么要講一個(gè)跟WB操作沒(méi)關(guān)系的步驟呢？說(shuō)好的WB進(jìn)階呢？其實(shí)，這往往是很多新手忽視的關(guān)鍵點(diǎn)，對(duì)目的蛋白一知半解，是沒(méi)有辦法做好WB實(shí)驗(yàn)的，其他免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)也是一樣，可能有的小伙伴還不是特別相信，接下來(lái)讓小編帶大家看看為什么了解目的蛋白是如此的重要吧~ 了解目的蛋白對(duì)整個(gè)WB 實(shí)驗(yàn)的重要性： 1.了解目的蛋白，才知道目的蛋白在實(shí)驗(yàn)樣品中是否有表達(dá) WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，很多小伙伴會(huì)遇到的問(wèn)題之一就是無(wú)條帶，也就是陰性結(jié)果，如何判斷陰性結(jié)果是實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題造成的“假陰性”還是本該如此的“真陰性”，這就需要大家在實(shí)驗(yàn)前，就對(duì)目的蛋白有一個(gè)清晰的認(rèn)識(shí)。很多蛋白的表達(dá)是有組織特異性的，例如IL-10R，在視網(wǎng)膜，脾臟和肺腺癌組織中有高表達(dá)，其他組織表達(dá)含量較低；還有一些蛋白，則需要特定的刺激條件才會(huì)高表達(dá)，這種情況往往在磷酸化蛋白及炎癥因子蛋白等中較為常見，如果未做特殊的處理，目的蛋白表達(dá)含量很低，無(wú)法被WB檢測(cè)出。 2.了解目的蛋白，才知道如何制備樣本 樣本制備也是WB的關(guān)鍵步驟，后續(xù)的文章中也會(huì)為大家詳細(xì)分析。如何選擇合適的樣本制備方法，關(guān)鍵因素就是要了解目的蛋白；除了上面第一步中的要了解目的蛋白表達(dá)組織，及預(yù)處理?xiàng)l件外，還需確認(rèn)目的蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞定位，例如，細(xì)胞膜蛋白，核蛋白，線粒體蛋白和胞漿蛋白的提取方式都不一樣，選擇合適的方式，才能制備合格的樣品，方便后續(xù)的WB實(shí)驗(yàn)。另外一個(gè)需要注意的因素就是需要加入對(duì)應(yīng)的蛋白酶抑制劑，這一點(diǎn)對(duì)于磷酸化的蛋白尤為重要，否則蛋白在提取過(guò)程中就被降解，會(huì)造成“假陰性”結(jié)果。 3. 了解目的蛋白，才知道如何選擇內(nèi)參 內(nèi)參抗體，是WB實(shí)驗(yàn)中的重要參考，WB可以對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析，判斷不同樣品中目的蛋白表達(dá)含量的多少，就是取決于內(nèi)參的標(biāo)定。內(nèi)參選擇在WB實(shí)驗(yàn)中是很關(guān)鍵的因素，可不是GAPDH或者β-actin萬(wàn)用的哦。內(nèi)參如何選擇，最重要的決定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表達(dá)位置及預(yù)處理?xiàng)l件。小編在這里總結(jié)了一下內(nèi)參的選擇表，大家可以保存哦~ 好了，相信大家應(yīng)該知道實(shí)驗(yàn)前了解目的蛋白的重要性了吧，如何了解目的蛋白呢？可以通過(guò)UniProt網(wǎng)站搜尋蛋白的相關(guān)信息，也可以在Pubmed上查閱對(duì)應(yīng)的研究文獻(xiàn)，相信聰明的小伙伴們肯定可以做好的，今天的分享就先到這，接下來(lái)我們還會(huì)分享整個(gè)WB操作過(guò)程中的細(xì)節(jié)，如果您也有實(shí)驗(yàn)心得想分享給大家，歡迎投稿！ |
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