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Western Blot進(jìn)階技巧第一彈——從了解目的蛋白開始 已有4人參與
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蛋白質(zhì)印跡 (Western Blot)，相信大家對此都不陌生，做為檢測蛋白表達(dá)及半定量的基礎(chǔ)實驗方法，也是很多小伙伴們初入實驗室的第一門課。 “上手容易，精通難”可謂對WB實驗的最佳注釋，初入實驗室的“菜鳥”可以很快上手，做出漂亮的條帶，做過多年的“大神”也可能一著不慎，實驗“翻車”，結(jié)果一塌糊涂。有些實驗室甚至流傳著一些所謂的“玄學(xué)”，新手人品好，難做的條帶給新手做等等。 真的是這樣么？實驗技術(shù)可不是拼人品，靠運氣的事兒，接下來小編將會為大家?guī)鞼B進(jìn)階技巧系列，干貨滿滿，讓大家提升WB實驗技巧，成為真正的實驗“大神”。 首先，讓我們了解一下什么是WB實驗吧： ▲【定義】WB又稱為免疫印跡 (immune blot) ，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合半定量的檢測樣品中的某種蛋白的方法。 ▲【原理】通過凝膠電泳，將不同分子量大小的蛋白質(zhì)分離開，再利用特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。 ▲【應(yīng)用】定性檢測：目標(biāo)蛋白有無，分子量大小；定量檢測：檢測目標(biāo)蛋白含量（半定量）。 圖1. WB操作流程圖 看到這，相信之前對WB了解不多的同學(xué)也應(yīng)該對WB有了一個基礎(chǔ)的認(rèn)識。那么，怎樣可以把這看似簡單的幾步做好，拿到漂亮的實驗結(jié)果呢？話不多說，上干貨。 小編首先要強(qiáng)調(diào)的一點，就是了解目的蛋白，這也是今天這篇文章主要給大家分享的內(nèi)容。可能有的小伙伴會有疑問，為什么要講一個跟WB操作沒關(guān)系的步驟呢？說好的WB進(jìn)階呢？其實，這往往是很多新手忽視的關(guān)鍵點，對目的蛋白一知半解，是沒有辦法做好WB實驗的，其他免疫學(xué)實驗也是一樣，可能有的小伙伴還不是特別相信，接下來讓小編帶大家看看為什么了解目的蛋白是如此的重要吧~ 了解目的蛋白對整個WB 實驗的重要性： 1.了解目的蛋白，才知道目的蛋白在實驗樣品中是否有表達(dá) WB實驗檢測，很多小伙伴會遇到的問題之一就是無條帶，也就是陰性結(jié)果，如何判斷陰性結(jié)果是實驗操作問題造成的“假陰性”還是本該如此的“真陰性”，這就需要大家在實驗前，就對目的蛋白有一個清晰的認(rèn)識。很多蛋白的表達(dá)是有組織特異性的，例如IL-10R，在視網(wǎng)膜，脾臟和肺腺癌組織中有高表達(dá)，其他組織表達(dá)含量較低；還有一些蛋白，則需要特定的刺激條件才會高表達(dá)，這種情況往往在磷酸化蛋白及炎癥因子蛋白等中較為常見，如果未做特殊的處理，目的蛋白表達(dá)含量很低，無法被WB檢測出。 2.了解目的蛋白，才知道如何制備樣本 樣本制備也是WB的關(guān)鍵步驟，后續(xù)的文章中也會為大家詳細(xì)分析。如何選擇合適的樣本制備方法，關(guān)鍵因素就是要了解目的蛋白；除了上面第一步中的要了解目的蛋白表達(dá)組織，及預(yù)處理條件外，還需確認(rèn)目的蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞定位，例如，細(xì)胞膜蛋白，核蛋白，線粒體蛋白和胞漿蛋白的提取方式都不一樣，選擇合適的方式，才能制備合格的樣品，方便后續(xù)的WB實驗。另外一個需要注意的因素就是需要加入對應(yīng)的蛋白酶抑制劑，這一點對于磷酸化的蛋白尤為重要，否則蛋白在提取過程中就被降解，會造成“假陰性”結(jié)果。 3. 了解目的蛋白，才知道如何選擇內(nèi)參 內(nèi)參抗體，是WB實驗中的重要參考，WB可以對目的蛋白進(jìn)行半定量分析，判斷不同樣品中目的蛋白表達(dá)含量的多少，就是取決于內(nèi)參的標(biāo)定。內(nèi)參選擇在WB實驗中是很關(guān)鍵的因素，可不是GAPDH或者β-actin萬用的哦。內(nèi)參如何選擇，最重要的決定因素就是目的蛋白，尤其是目的蛋白的表達(dá)位置及預(yù)處理條件。小編在這里總結(jié)了一下內(nèi)參的選擇表，大家可以保存哦~ 好了，相信大家應(yīng)該知道實驗前了解目的蛋白的重要性了吧，如何了解目的蛋白呢？可以通過UniProt網(wǎng)站搜尋蛋白的相關(guān)信息，也可以在Pubmed上查閱對應(yīng)的研究文獻(xiàn)，相信聰明的小伙伴們肯定可以做好的，今天的分享就先到這，接下來我們還會分享整個WB操作過程中的細(xì)節(jié)，如果您也有實驗心得想分享給大家，歡迎投稿！ |
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