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lyq123456新蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助有關(guān)異二聚體蛋白構(gòu)建純化問(wèn)題 已有2人參與
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我想純化一個(gè)細(xì)胞因子的兩個(gè)受體亞基的異二聚體蛋白，但是不清楚是不是用linker連接就可以？或者用多長(zhǎng)的linker才不會(huì)影響兩個(gè)受體蛋白的表達(dá)和正常折疊？有前輩有比較好的構(gòu)建純化這種異二聚體的經(jīng)驗(yàn)和方法嗎？求賜教！��！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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pennchem
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2樓2020-05-30 19:56:17
zsygxh
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【答案】應(yīng)助回帖
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沒(méi)有同時(shí)表達(dá)過(guò)異源二聚體，說(shuō)說(shuō)個(gè)人的想法 首先用linker連接是不行的，因?yàn)檫@樣表達(dá)出來(lái)就是一個(gè)蛋白而不是兩個(gè)亞基了，肯定影響折疊。 想到的方法： 1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化：將兩個(gè)亞基分別連入兩個(gè)不同的質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)化表達(dá)，注意選用雙抗性進(jìn)行篩選 2. 多順?lè)醋颖磉_(dá)：在同一個(gè)質(zhì)粒的啟動(dòng)子-終止子之間插入兩個(gè)亞基的基因，并各自帶RBS、起始密碼子和終止密碼子，這樣轉(zhuǎn)錄出一條mRNA，在這條mRNA上有兩個(gè)RBS，分別結(jié)合核糖體翻譯兩個(gè)蛋白。這個(gè)可以自己構(gòu)建，也有商業(yè)化載體pETDuet。 3. 分別表達(dá)純化兩個(gè)蛋白，獲得各自的單體，體外優(yōu)化條件進(jìn)行孵育，有相互作用，亞基結(jié)合，再用分子篩分離純化去除沒(méi)結(jié)合的單體。若表達(dá)純化的單體不穩(wěn)定，可以分別用尿素或鹽酸胍加還原劑進(jìn)行變性處理，再按等摩爾比混合，之后嘗試復(fù)性，再純化分離出正確折疊的二聚體。 |
3樓2020-06-12 16:53:17
liudayeye
木蟲 (正式寫手)
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你是要得到融合蛋白還是要得到什么？融合蛋白的話，多做幾組linker，剛性和柔性的都做一些。如果你的目的是其他，就不用思考這個(gè)問(wèn)題了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2021-07-21 12:04:34
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