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lyq123456新蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助有關異二聚體蛋白構建純化問題 已有2人參與
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我想純化一個細胞因子的兩個受體亞基的異二聚體蛋白，但是不清楚是不是用linker連接就可以？或者用多長的linker才不會影響兩個受體蛋白的表達和正常折疊？有前輩有比較好的構建純化這種異二聚體的經(jīng)驗和方法嗎？求賜教！��！ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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pennchem
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2樓2020-05-30 19:56:17
zsygxh
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【答案】應助回帖
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沒有同時表達過異源二聚體，說說個人的想法 首先用linker連接是不行的，因為這樣表達出來就是一個蛋白而不是兩個亞基了，肯定影響折疊。 想到的方法： 1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化：將兩個亞基分別連入兩個不同的質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)化表達，注意選用雙抗性進行篩選 2. 多順反子表達：在同一個質(zhì)粒的啟動子-終止子之間插入兩個亞基的基因，并各自帶RBS、起始密碼子和終止密碼子，這樣轉(zhuǎn)錄出一條mRNA，在這條mRNA上有兩個RBS，分別結合核糖體翻譯兩個蛋白。這個可以自己構建，也有商業(yè)化載體pETDuet。 3. 分別表達純化兩個蛋白，獲得各自的單體，體外優(yōu)化條件進行孵育，有相互作用，亞基結合，再用分子篩分離純化去除沒結合的單體。若表達純化的單體不穩(wěn)定，可以分別用尿素或鹽酸胍加還原劑進行變性處理，再按等摩爾比混合，之后嘗試復性，再純化分離出正確折疊的二聚體。 |
3樓2020-06-12 16:53:17
liudayeye
木蟲 (正式寫手)
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4樓2021-07-21 12:04:34
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