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huajiachicat新蟲 (初入文壇)
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[交流]
克隆某未知基因片段，高保真酶仍然遇到突變并改變氨基酸，就問怎么辦 已有3人參與
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基因克隆新手求助： 我最近想要研究某個昆蟲的基因，由于并非模式生物，沒有任何之前研究，唯一可以用的reference就是組學(xué)拼接data。設(shè)計引物擴增長度大約1500bp，共2個片段，從cDNA文庫中擴增，一開始用LA Taq，后來在某合作者（PI）建議下用高保真酶又做了一次。高保真酶是NEB的Q5高保真酶（從未開封但在負20度放置了3年），用普通Taq加A。克隆載體用的是pGEM-T Easy，感受態(tài)自制DH5a。 結(jié)果是片段1，LA擴增產(chǎn)物連接挑到1個好的克隆，Q5挑到2個。序列完全一樣，但是對比reference卻發(fā)現(xiàn)有5個位點不同。大致效果如下： FG1: Ref: G C A T LA-11: A T C C q5-01: A T C C q5-03: A T C C 片段2，僅用了Q5高保真酶，挑了3個克隆，但卻發(fā)現(xiàn)這三個克隆彼此和reference都有較多區(qū)別，其中2個氨基酸發(fā)生改變。 Ref: G A A C A Q2: A G A T G Q3: A G G T A Q4: A G A T A 我的目的是連接兩條片段并進行表達，因此序列正確與否十分重要。請問 1. FG1的三個克隆序列都一致且來源于不同PCR體系，是否可以認為其序列是正確的，而reference的結(jié)果需要修正？ 2. FG2三個克隆和reference序列不同且彼此都不同，該如何解決？差異到底是PCR突變還是reference本身問題。 謝謝！��！ |
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4樓2020-03-18 17:29:03
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