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tq0ax1r新蟲 (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒能表達MBP融合蛋白，不能表達目標蛋白，向大神求解！ 已有4人參與
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最近新構(gòu)建了一個新的質(zhì)粒，本人在這方面經(jīng)驗不足，插入序列就是網(wǎng)上搜到的wide type序列，沒有做任何改變，是一個人源蛋白。原質(zhì)粒是PET系列帶MBP融合蛋白，在Rosetta大腸桿菌里表達，沒有插入序列的空質(zhì)粒能大量表達MBP，但是把序列插入在MBP后SDSPAGE上沒有看到表達蛋白條帶。請問： 1. 想過換宿主菌，但是既然同樣的質(zhì)粒在這里能表達MBP，不能表達MBP+新蛋白，是否不是宿主菌的原因？ 2. 試過20度，25度，OD = 0.7，0.8，0.9誘導(dǎo)，沒有區(qū)別 3. 想嘗試換培養(yǎng)基，目前我只知道LB和M9，除此以外大家還能告知一些其它可以嘗試的培養(yǎng)基嗎？ 4. 想過是否是因為我用的原基因序列，沒有做密碼子優(yōu)化，網(wǎng)上可以做codon optimization，打算嘗試一下，重新合成然后再插入這個質(zhì)粒，大家覺得會有效果嗎？P.S. rosetta本身就有表達稀有密碼子的優(yōu)勢，所以我一開始沒有在意這點，到現(xiàn)在也不知道到底是不是密碼子沒優(yōu)化的原因。 5. 有人提議直接換質(zhì)粒，我對不同質(zhì)粒了解甚少，大家有什么推薦？ 讀碼框都確認過，測序也是對的，這些應(yīng)該不是問題，當然老板也建議重新?lián)Q家公司再測一次序列。 請有經(jīng)驗的大神賜教，感激不盡！ |
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