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tq0ax1r新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
質(zhì)粒能表達(dá)MBP融合蛋白，不能表達(dá)目標(biāo)蛋白，向大神求解！ 已有4人參與
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最近新構(gòu)建了一個(gè)新的質(zhì)粒，本人在這方面經(jīng)驗(yàn)不足，插入序列就是網(wǎng)上搜到的wide type序列，沒(méi)有做任何改變，是一個(gè)人源蛋白。原質(zhì)粒是PET系列帶MBP融合蛋白，在Rosetta大腸桿菌里表達(dá)，沒(méi)有插入序列的空質(zhì)粒能大量表達(dá)MBP，但是把序列插入在MBP后SDSPAGE上沒(méi)有看到表達(dá)蛋白條帶。請(qǐng)問(wèn)： 1. 想過(guò)換宿主菌，但是既然同樣的質(zhì)粒在這里能表達(dá)MBP，不能表達(dá)MBP+新蛋白，是否不是宿主菌的原因？ 2. 試過(guò)20度，25度，OD = 0.7，0.8，0.9誘導(dǎo)，沒(méi)有區(qū)別 3. 想嘗試換培養(yǎng)基，目前我只知道LB和M9，除此以外大家還能告知一些其它可以嘗試的培養(yǎng)基嗎？ 4. 想過(guò)是否是因?yàn)槲矣玫脑蛐蛄�，沒(méi)有做密碼子優(yōu)化，網(wǎng)上可以做codon optimization，打算嘗試一下，重新合成然后再插入這個(gè)質(zhì)粒，大家覺(jué)得會(huì)有效果嗎？P.S. rosetta本身就有表達(dá)稀有密碼子的優(yōu)勢(shì)，所以我一開(kāi)始沒(méi)有在意這點(diǎn)，到現(xiàn)在也不知道到底是不是密碼子沒(méi)優(yōu)化的原因。 5. 有人提議直接換質(zhì)粒，我對(duì)不同質(zhì)粒了解甚少，大家有什么推薦？ 讀碼框都確認(rèn)過(guò)，測(cè)序也是對(duì)的，這些應(yīng)該不是問(wèn)題，當(dāng)然老板也建議重新?lián)Q家公司再測(cè)一次序列。 請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的大神賜教，感激不盡！ |
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2樓2019-02-05 11:14:59
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3樓2019-02-12 16:19:41
4樓2019-02-13 14:11:13
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5樓2019-02-15 14:37:25
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【答案】應(yīng)助回帖
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質(zhì)粒測(cè)序過(guò)嗎？確定克隆成功了？感覺(jué)很有可能是克隆的問(wèn)題，建議檢查引物重做pcr。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
6樓2019-04-10 13:27:29
墨竹韻
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7樓2025-04-12 10:49:37
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