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cindyyue19金蟲 (小有名氣)
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[交流]
大腸桿菌蛋白表達(dá)時(shí)用何種方法去除N端甲硫氨酸?
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| 最近想要表達(dá)蛋白，想要去掉N端的甲硫氨酸，請(qǐng)問哪位高手能指導(dǎo)一二? |
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zsygxh
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cindyyue19: 金幣+1 2020-10-07 09:56:36
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cindyyue19: 金幣+1 2020-10-07 09:56:36
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我前面的表述可能有點(diǎn)問題。我本意是想說，如果你是在實(shí)驗(yàn)室里，需要幾十到幾百mg蛋白用于實(shí)驗(yàn)研究，那么直接重新構(gòu)建質(zhì)粒，在N端連上一個(gè)能完全去除的標(biāo)簽就行了，這樣簡單、方便、高效。如果你是在藥企或其它單位，需要大量生產(chǎn)這個(gè)蛋白的話，那么需要考慮產(chǎn)量的問題。比如，在菌體表達(dá)蛋白總量相當(dāng)?shù)那闆r下，融合標(biāo)簽越長，目的蛋白占總蛋白比例就越少，所以產(chǎn)量就越少，而如果你的目的蛋白分子量本身就很小，那影響會(huì)更明顯。再比如，序列發(fā)生變化，表達(dá)量也會(huì)變化，極端（且常見）情況下甚至不表達(dá)。所以如果是生產(chǎn)的情況，建議你嘗試構(gòu)建多種不同的標(biāo)簽，根據(jù)實(shí)際表達(dá)來定奪（需要考慮融合蛋白的表達(dá)總量，蛋白結(jié)構(gòu)/活性的變化，副產(chǎn)物對(duì)后續(xù)工藝的影響等等，比較麻煩）。我前面語境好像在說融合標(biāo)簽不適合生產(chǎn)，其實(shí)融合在生物制藥生產(chǎn)中是很常見的，這其實(shí)只是我表述有問題。其它能夠徹底、均一地切除fMet并且不對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)造成影響的方法，目前我不太清楚。 |
cindyyue196樓2020-09-25 16:38:59
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2樓2020-09-22 07:08:12
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3樓2020-09-22 08:04:34
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cindyyue19: 金幣+8 2020-09-22 16:58:31
| 首位的甲酰甲硫氨酸(fMet)在胞內(nèi)能被部分切除，切除的效率受第二位氨基酸側(cè)鏈的影響較大，不同序列切割率差異比較大。如果你是想要純化一些均一的不含fMet的目的蛋白做實(shí)驗(yàn)，而不是用于大量生產(chǎn)的話，建議你在序列前面融合能完全切除的標(biāo)簽，比如在前面融合DDDDK，純化后用腸激酶切除，或者融合sumo標(biāo)簽，用ULP1切除，能得到均一的目的蛋白。 |
4樓2020-09-22 13:24:19
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