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Ma丶lone新蟲(chóng) (初入文壇)
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求助，畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)阿魏酸酯酶，蛋白沒(méi)有活性，可能哪些問(wèn)題，該怎么解決現(xiàn)狀？ 已有2人參與
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本人初入分子生物，用PPIZCA質(zhì)粒重組了阿魏酸酯酶的基因序列，然后我把重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母中。結(jié)果是，PCR和測(cè)序驗(yàn)證基因大小和序列沒(méi)問(wèn)題，western blot也做了能看到所在處清晰的條帶，但是有一次出現(xiàn)了包涵體，這一次沒(méi)有，我用這一次的粗酶液和提純的蛋白測(cè)試酶活性，結(jié)果一點(diǎn)活性沒(méi)有。請(qǐng)教大佬幫我分析一下可能的原因和解決辦法。 @gyesang @hc-material 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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3樓2021-03-28 12:48:27
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2樓2021-03-28 11:07:24
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4樓2021-03-28 22:42:20
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5樓2021-03-28 22:43:01
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嗯嗯，我的是胞內(nèi)表達(dá)，用的200w，10s超聲，10s停止，一共20min的超聲條件，加了ripa和pi，我這個(gè)是水解酶，不知道是我在提的過(guò)程中失活了。對(duì)了，我的粗酶液酶活檢測(cè)，是我50毫升培養(yǎng)液取了100微升的上清做的活性檢測(cè)，這個(gè)量是有些少了嗎？一般需要富集粗酶液?jiǎn)幔?br /> 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
6樓2021-03-30 14:18:56
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嗯嗯，老師告訴我會(huì)不會(huì)是胞內(nèi)有抑制活性的，你知道假如胞內(nèi)有抑制酶活的物質(zhì)，該如何避免呢，加什么東西嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
7樓2021-03-30 14:21:03
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8樓2021-03-30 14:21:59
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可溶提純的，我有histag標(biāo)簽我用的親和層析法提純的。我的基因序列對(duì)，電泳分子大小也對(duì)，蛋白條帶也對(duì)，就是酶活沒(méi)有。這個(gè)你碰到過(guò)嗎？還是我酶活檢測(cè)的樣品太少了嗎？或者中間被我弄失活了？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
9樓2021-03-30 14:24:29
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10樓2021-03-30 20:02:07
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