 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 68 | 回復(fù): 0 | |||
畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
|
[交流]
實(shí)驗(yàn)前的常見問題與預(yù)防措施💭
|
|
1. DNA樣本質(zhì)量問題及預(yù)防方法 DNA質(zhì)量直接關(guān)系到酶切效率，這可不是開玩笑的！上個(gè)月我們實(shí)驗(yàn)室有個(gè)小師妹因?yàn)镈NA樣本質(zhì)量差，重復(fù)了整整三次實(shí)驗(yàn)都沒成功，簡直崩潰😭 常見問題： DNA樣本中含有蛋白質(zhì)、RNA或其他雜質(zhì) DNA降解嚴(yán)重 DNA含有酚、氯仿等提取試劑殘留 預(yù)防措施： 提取DNA時(shí)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作，避免交叉污染 使用新鮮的RNase處理去除RNA雜質(zhì) 最后一步洗滌務(wù)必充分，去除殘留試劑 劃重點(diǎn)！ DNA純度A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，低于1.8說明蛋白質(zhì)污染，高于2.0可能存在RNA污染！測量濃度時(shí)，建議使用Nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳雙重驗(yàn)證樣本質(zhì)量 寶藏建議： 在酶切前先進(jìn)行DNA純化預(yù)處理！我常用的方法是用聚乙二醇(PEG)沉淀法進(jìn)行二次純化，效果簡直不要太好！ 2. 酶活性下降的原因及檢測方法 還記得我第一次獨(dú)立做雙酶切實(shí)驗(yàn)嗎？結(jié)果酶切效率極低，后來才發(fā)現(xiàn)是酶活性問題，現(xiàn)在我每次實(shí)驗(yàn)前都會(huì)先檢查酶活性！ 常見原因： 酶儲(chǔ)存不當(dāng)，反復(fù)凍融 酶過期或質(zhì)量問題 反應(yīng)體系中含有抑制劑 檢測方法： 使用已知可被該酶切割的DNA進(jìn)行平行對(duì)照試驗(yàn) 檢查酶的儲(chǔ)存溫度記錄 查看酶的生產(chǎn)日期和失效日期 劃重點(diǎn)！ 限制性內(nèi)切酶對(duì)溫度極為敏感！取用時(shí)務(wù)必放在冰上操作，每次使用后立即放回-20℃冰箱，避免在室溫下放置超過5分鐘！❄️ 寶藏建議： 我們實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在都會(huì)做"酶活性月檢"，每月用標(biāo)準(zhǔn)底物檢測一次關(guān)鍵酶的活性并記錄，這樣可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題酶，避免實(shí)驗(yàn)失敗 3. 非特異性切割的產(chǎn)生原因及避免技巧 這個(gè)問題真的超煩人！上學(xué)期我們組有個(gè)博士生的克隆實(shí)驗(yàn)總是失敗，最后發(fā)現(xiàn)就是因?yàn)榉翘禺愋郧懈顚?dǎo)致的！ 產(chǎn)生原因： Star activity（星狀活性）：酶在非最適條件下切割非特異位點(diǎn) 酶用量過高，導(dǎo)致降解性切割 反應(yīng)時(shí)間過長 DNA甲基化干擾了酶識(shí)別位點(diǎn) 避免技巧： 嚴(yán)格遵循酶供應(yīng)商推薦的反應(yīng)條件 精確計(jì)算酶的用量，避免過量 控制反應(yīng)時(shí)間，必要時(shí)做時(shí)間梯度預(yù)實(shí)驗(yàn) 考慮使用甲基化不敏感的同源酶 劃重點(diǎn)！ 高質(zhì)量限制性內(nèi)切酶的專一性很高，但在甘油濃度高、pH不合適、Mg²⁺濃度異常時(shí)都可能產(chǎn)生Star activity！使用酶時(shí)，甘油終濃度不要超過5%！ 寶藏建議： 雙酶切時(shí)，先用切割效率較高的那個(gè)酶進(jìn)行反應(yīng)，再用另一個(gè)酶，而不是一次加入兩種酶！我發(fā)現(xiàn)這樣可以大大降低非特異性切割的發(fā)生概率 4. 污染源識(shí)別與防控措施 這是我們實(shí)驗(yàn)室的"老大難"問題！有次我們組連續(xù)兩周的實(shí)驗(yàn)都因?yàn)槲廴径。詈蟀l(fā)現(xiàn)是移液器被污染了 常見污染源： 核酸酶污染，特別是RNase和DNase 實(shí)驗(yàn)器材交叉污染 操作者手套污染 試劑污染 防控措施： 使用DEPC處理的水和無核酸酶的試劑 實(shí)驗(yàn)前用75%酒精擦拭工作臺(tái) 定期對(duì)移液器進(jìn)行滅菌處理 勤換手套，避免接觸可能含有核酸酶的物品 劃重點(diǎn)！ 人手是核酸酶的主要來源！即使戴了手套也要避免用手直接接觸反應(yīng)管內(nèi)壁、試劑蓋等關(guān)鍵部位！ 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
新疆大學(xué)地質(zhì)與礦業(yè)工程學(xué)院招生
已經(jīng)有32人回復(fù)
-
0856材料與化工353分求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
282分材料專業(yè)求調(diào)劑院校
已經(jīng)有13人回復(fù)
-
315食品工程求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
環(huán)境調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
接受26屆調(diào)劑生
已經(jīng)有20人回復(fù)
-
考研材料與化工，求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
歡迎211本科同學(xué)，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠(yuǎn)一本，交叉學(xué)科課題組
已經(jīng)有35人回復(fù)
-
304求調(diào)劑（085602一志愿985）
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
294 英二數(shù)二物化 求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 畢合生物2024 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +6 | 小奶蒼 2026-03-07 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +3 | wyx79618 2026-03-06 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 290 材料與化工求調(diào)劑 +7 | Nebulala 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 26申博自薦 +9 | 烷基八氮- 2026-03-06 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +9 | wxz2 2026-03-03 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 招調(diào)劑 +20 | 帆船哥 2026-03-04 | 23/1150 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +8 | Trying] 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 進(jìn)入個(gè)人成果庫好難，一下午都沒進(jìn)去 +6 | mi_dilee 2026-03-05 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 081700學(xué)碩一志愿北京化工大學(xué)數(shù)二英一過六級(jí)有競賽求調(diào)劑 +5 | galaxary 2026-03-07 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)290求調(diào)劑 +3 | 兩顆 西柚 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | 呼呼？~+123456 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | 呼呼？~+123456 2026-03-06 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +7 | 倘若起風(fēng)了呢 2026-03-05 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 306求調(diào)劑 +7 | Bahati 2026-03-05 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +6 | Trying] 2026-03-05 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 考研282分求調(diào)劑，接受跨專業(yè) +4 | 劉淄博 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 學(xué)碩材料275調(diào)劑 +9 | 路三三 2026-03-03 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +4 | 杰尼龜aaa 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 306求調(diào)劑 +7 | 張張張張oo 2026-03-03 | 7/350 |
|