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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
實驗前的常見問題與預防措施💭
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1. DNA樣本質量問題及預防方法 DNA質量直接關系到酶切效率，這可不是開玩笑的！上個月我們實驗室有個小師妹因為DNA樣本質量差，重復了整整三次實驗都沒成功，簡直崩潰😭 常見問題： DNA樣本中含有蛋白質、RNA或其他雜質 DNA降解嚴重 DNA含有酚、氯仿等提取試劑殘留 預防措施： 提取DNA時嚴格按照標準流程操作，避免交叉污染 使用新鮮的RNase處理去除RNA雜質 最后一步洗滌務必充分，去除殘留試劑 劃重點！ DNA純度A260/A280比值應在1.8-2.0之間，低于1.8說明蛋白質污染，高于2.0可能存在RNA污染！測量濃度時，建議使用Nanodrop和瓊脂糖凝膠電泳雙重驗證樣本質量 寶藏建議： 在酶切前先進行DNA純化預處理！我常用的方法是用聚乙二醇(PEG)沉淀法進行二次純化，效果簡直不要太好！ 2. 酶活性下降的原因及檢測方法 還記得我第一次獨立做雙酶切實驗嗎？結果酶切效率極低，后來才發(fā)現是酶活性問題，現在我每次實驗前都會先檢查酶活性！ 常見原因： 酶儲存不當，反復凍融 酶過期或質量問題 反應體系中含有抑制劑 檢測方法： 使用已知可被該酶切割的DNA進行平行對照試驗 檢查酶的儲存溫度記錄 查看酶的生產日期和失效日期 劃重點！ 限制性內切酶對溫度極為敏感！取用時務必放在冰上操作，每次使用后立即放回-20℃冰箱，避免在室溫下放置超過5分鐘！❄️ 寶藏建議： 我們實驗室現在都會做"酶活性月檢"，每月用標準底物檢測一次關鍵酶的活性并記錄，這樣可以及時發(fā)現問題酶，避免實驗失敗 3. 非特異性切割的產生原因及避免技巧 這個問題真的超煩人！上學期我們組有個博士生的克隆實驗總是失敗，最后發(fā)現就是因為非特異性切割導致的！ 產生原因： Star activity（星狀活性）：酶在非最適條件下切割非特異位點 酶用量過高，導致降解性切割 反應時間過長 DNA甲基化干擾了酶識別位點 避免技巧： 嚴格遵循酶供應商推薦的反應條件 精確計算酶的用量，避免過量 控制反應時間，必要時做時間梯度預實驗 考慮使用甲基化不敏感的同源酶 劃重點！ 高質量限制性內切酶的專一性很高，但在甘油濃度高、pH不合適、Mg²⁺濃度異常時都可能產生Star activity！使用酶時，甘油終濃度不要超過5%！ 寶藏建議： 雙酶切時，先用切割效率較高的那個酶進行反應，再用另一個酶，而不是一次加入兩種酶！我發(fā)現這樣可以大大降低非特異性切割的發(fā)生概率 4. 污染源識別與防控措施 這是我們實驗室的"老大難"問題！有次我們組連續(xù)兩周的實驗都因為污染而失敗，最后發(fā)現是移液器被污染了 常見污染源： 核酸酶污染，特別是RNase和DNase 實驗器材交叉污染 操作者手套污染 試劑污染 防控措施： 使用DEPC處理的水和無核酸酶的試劑 實驗前用75%酒精擦拭工作臺 定期對移液器進行滅菌處理 勤換手套，避免接觸可能含有核酸酶的物品 劃重點！ 人手是核酸酶的主要來源！即使戴了手套也要避免用手直接接觸反應管內壁、試劑蓋等關鍵部位！ 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務內容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關、生命科學、天然產物 |
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