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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 綜合其他 » 關于細胞轉染的一些注意事項
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關于細胞轉染的一些注意事項
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細胞轉染指的是將外源核酸（如DNA、RNA、siRNA等）通過物理、化學或生物方法導入真核細胞內，使細胞獲得新的遺傳特性的過程。目前廣泛應用于基因功能研究、蛋白質表達、藥物篩選等領域，其效率直接決定了后續(xù)實驗的成敗與數(shù)據(jù)可靠性。轉染效率的高低，不是單一因素決定的。與細胞狀態(tài)，轉染試劑，操作步驟密切相關。那么如何提高細胞轉染效率呢?01細胞狀態(tài)是前提 轉染是把外源核酸（DNA/RNA）送進細胞，對于細胞來說屬于一種應激。如果細胞本身狀態(tài)不好，轉染效率會顯著降低。①傳代次數(shù)：轉染前細胞最好進行細胞傳代1-2次，使細胞生長旺盛容易轉染，避免使用高傳代次數(shù)的細胞，代次過高的細胞會出現(xiàn)衰老、形態(tài)異常，轉染效率直線下降。②細胞狀態(tài)：使用處于對數(shù)生長期（通常50-70%匯合度）的細胞，避免過度生長或狀態(tài)不佳的細胞。③保證細胞純凈沒有污染：支原體、細菌污染是轉染的殺手，污染會破壞細胞內環(huán)境，導致細胞代謝紊亂，導致轉染效率降低。02轉染的核酸也是重點 純度：選用高純度 DNA 或 RNA（DNA 的A260/A280 比值接近 1.8），可提升轉染效率，使用去內毒素試劑盒提取質粒DNA；若轉染 siRNA，需全程使用無 RNase 的試劑與耗材，防止 RNA 被酶解降解。濃度：核酸濃度需控制在合理范圍：濃度過高易引發(fā)細胞毒性，過低則轉染效率不足；質粒 DNA 濃度控制在 1000 ng/μL左右，最少大于500ng/μL。03培養(yǎng)條件 血清：血清會降低轉染效率，在配制 DNA 與陽離子脂質體試劑的稀釋液時，需要采用無血清培養(yǎng)基。這是因為血清中富含大量帶負電荷的蛋白質，可與陽離子脂質體或陽離子聚合物競爭結合核酸，干擾轉染復合物的有效形成，進而影響轉染效率。但是當轉染復合物已穩(wěn)定形成后，在加入細胞前可適量添加血清。雙抗：避免培養(yǎng)基中含有抗生素，抗生素會加重細胞應激，尤其是轉染后細胞狀態(tài)較弱，容易導致細胞死亡（轉染后24h內盡量不用抗生素）。04操作手法 溫柔對待細胞: 加轉染復合物時,懸空轉圈滴加進入培養(yǎng)皿或者細胞孔板，滴加后輕輕搖晃培養(yǎng)皿打），讓復合物均勻分布，但不要劇烈震蕩，轉染后將細胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。正式實驗前，一般需要根據(jù)說明書，設置一系列梯度對核酸/轉染試劑比例進行摸索，選擇最佳組合作為后續(xù)轉染條件。j具體實驗步驟按照說明書操作。 |
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