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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的一些注意事項(xiàng)
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細(xì)胞轉(zhuǎn)染指的是將外源核酸（如DNA、RNA、siRNA等）通過物理、化學(xué)或生物方法導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞獲得新的遺傳特性的過程。目前廣泛應(yīng)用于基因功能研究、蛋白質(zhì)表達(dá)、藥物篩選等領(lǐng)域，其效率直接決定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗與數(shù)據(jù)可靠性。轉(zhuǎn)染效率的高低，不是單一因素決定的。與細(xì)胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染試劑，操作步驟密切相關(guān)。那么如何提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率呢?01細(xì)胞狀態(tài)是前提 轉(zhuǎn)染是把外源核酸（DNA/RNA）送進(jìn)細(xì)胞，對(duì)于細(xì)胞來說屬于一種應(yīng)激。如果細(xì)胞本身狀態(tài)不好，轉(zhuǎn)染效率會(huì)顯著降低。①傳代次數(shù)：轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好進(jìn)行細(xì)胞傳代1-2次，使細(xì)胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染，避免使用高傳代次數(shù)的細(xì)胞，代次過高的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)衰老、形態(tài)異常，轉(zhuǎn)染效率直線下降。②細(xì)胞狀態(tài)：使用處于對(duì)數(shù)生長期（通常50-70%匯合度）的細(xì)胞，避免過度生長或狀態(tài)不佳的細(xì)胞。③保證細(xì)胞純凈沒有污染：支原體、細(xì)菌污染是轉(zhuǎn)染的殺手，污染會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。02轉(zhuǎn)染的核酸也是重點(diǎn) 純度：選用高純度 DNA 或 RNA（DNA 的A260/A280 比值接近 1.8），可提升轉(zhuǎn)染效率，使用去內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒DNA；若轉(zhuǎn)染 siRNA，需全程使用無 RNase 的試劑與耗材，防止 RNA 被酶解降解。濃度：核酸濃度需控制在合理范圍：濃度過高易引發(fā)細(xì)胞毒性，過低則轉(zhuǎn)染效率不足；質(zhì)粒 DNA 濃度控制在 1000 ng/μL左右，最少大于500ng/μL。03培養(yǎng)條件 血清：血清會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，在配制 DNA 與陽離子脂質(zhì)體試劑的稀釋液時(shí)，需要采用無血清培養(yǎng)基。這是因?yàn)檠逯懈缓罅繋ж?fù)電荷的蛋白質(zhì)，可與陽離子脂質(zhì)體或陽離子聚合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核酸，干擾轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率。但是當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)合物已穩(wěn)定形成后，在加入細(xì)胞前可適量添加血清。雙抗：避免培養(yǎng)基中含有抗生素，抗生素會(huì)加重細(xì)胞應(yīng)激，尤其是轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)較弱，容易導(dǎo)致細(xì)胞死亡（轉(zhuǎn)染后24h內(nèi)盡量不用抗生素）。04操作手法 溫柔對(duì)待細(xì)胞: 加轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí),懸空轉(zhuǎn)圈滴加進(jìn)入培養(yǎng)皿或者細(xì)胞孔板，滴加后輕輕搖晃培養(yǎng)皿打），讓復(fù)合物均勻分布，但不要?jiǎng)×艺鹗帲D(zhuǎn)染后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。正式實(shí)驗(yàn)前，一般需要根據(jù)說明書，設(shè)置一系列梯度對(duì)核酸/轉(zhuǎn)染試劑比例進(jìn)行摸索，選擇最佳組合作為后續(xù)轉(zhuǎn)染條件。j具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書操作。 |
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