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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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Westen Blot內參基因如何選
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類比與qPCR實驗，Westen blot實驗是從蛋白水平檢測基因的表達情況，而在檢測過程中內參基因的表達是相對恒定的。 因此我們在探究目的基因受實驗處理影響表達時需要挑選適合的目的基因作為內參，再進一步與實驗對照組比較目的基因的相對表達量。 目前在實驗中比較常用的內參基因主要為GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）。 以下先針對這三個常用的內參蛋白進行講解。 1 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶） GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是在細胞代謝糖酵解中起關鍵作用的酶，由4個30-40kDa的亞基組成，檢測條帶大約在36kDa。 它的表達量通常較高，在相同的細胞或組織中的表達量比較恒定。但是在缺氧和糖尿病等疾病情況中，GAPDH表達可能會發(fā)生變化，因此在這些情況下不推薦作為內參。 2 Actin（肌動蛋白） Actin是構成細胞骨架的主要蛋白之一。最常用作內參蛋白的是β-actin，檢測條帶大約在分子量42kDa。 它在許多真核細胞中都有廣泛且穩(wěn)定的表達，適用于全細胞和細胞質樣品。 3 Tubulin（微管蛋白） Tubulin是構成微管網絡的重要蛋白。最常用作內參蛋白的是β-tubulin，檢測條帶大約在55 kDa。 微管蛋白與維持細胞形態(tài)和分裂過程有關，因此它的表達水平可能受細胞狀態(tài)變化的影響�？股睾涂褂薪z分裂耐藥的細胞，Tubulin微管蛋白表達可能存在差異，即耐藥性研究可能不建議用Tubulin作為內參蛋白。 以下是在挑選內參的一些參考建議： 1 針對樣本而言 首先考慮樣品的物種來源、目的蛋白的表達部位例如全細胞、細胞核、細胞質、細胞膜或者血清 、血漿樣本等。 哺乳動物的細胞或者組織樣本一般可選擇GAPDH、actin、tubulin（全細胞）、ATP1A1（細胞膜蛋白）、Histone H3（核蛋白）、Lamin（細胞核膜）、COX412（線粒體）、Albumin（全血、血漿、血清）作內參。 而一些稀有物種具體需要通過查閱文獻選擇比較保守的管家基因作為蛋白內參。 2 蛋白分子量選擇 a 原則上選擇的內參與通常應該保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5 KDa以上。 例如PTEN(47-55KDa)，此時內參選擇GAPDH比較合適，NF-κb（65-70KDa）,此時β-actin較合適，GAPDH也可以。 另外，若是分子量為42-45kDa，此時不適宜選擇β-actin 作為內參，可以考慮選擇GAPDH或β-tubulin作為內參。另外兩種內參也是相同情況。 b 內參和目的蛋白也不是相差越大越好 轉膜時間不好控制，若內參太小，目的蛋白太大，會導致內參轉膜過度或者目的蛋白未完全轉上。此情況需要分開轉膜。 保證穩(wěn)定性，內參蛋白需要在不同樣本中穩(wěn)定表達，以確保實驗結果的可靠性。如果內參蛋白的表達水平與目的蛋白相差過大，可能會對目的蛋白的檢測產生干擾。 另外若是同時處理多個樣本，將目的蛋白和內參分開進行檢測可以同時處理多個樣本，提高實驗效率。如果內參和目的蛋白的表達水平相差過大，可能需要調整上樣量和抗體濃度，這可能會降低實驗效率。 3 細胞 、組織特異性 在選擇內參時，在考量實驗條件和研究背景下，不同的細胞類型和實驗目的可能需要不同的內參。 例如我們在做多細胞、多組織樣本或者動物實驗樣本對比表達量時，GAPDH作為內參是比較合適，因為GAPDH作為細胞代謝過程中 關鍵酶類蛋白，在組織中表達比較恒定。 而β-Actin和β-Tubulin是細胞骨架成分的 結構蛋白，不同組織的細胞結構會有差異性。 4 內參帶條齊、目的蛋白有趨勢 基本前提： 內參選擇正確 上樣量一致 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務內容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關、生命科學、天然產物 |
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