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畢合生物2024銅蟲(chóng) (小有名氣)
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Westen Blot內(nèi)參基因如何選
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類比與qPCR實(shí)驗(yàn)，Westen blot實(shí)驗(yàn)是從蛋白水平檢測(cè)基因的表達(dá)情況，而在檢測(cè)過(guò)程中內(nèi)參基因的表達(dá)是相對(duì)恒定的。 因此我們?cè)谔骄磕康幕蚴軐?shí)驗(yàn)處理影響表達(dá)時(shí)需要挑選適合的目的基因作為內(nèi)參，再進(jìn)一步與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較目的基因的相對(duì)表達(dá)量。 目前在實(shí)驗(yàn)中比較常用的內(nèi)參基因主要為GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）。 以下先針對(duì)這三個(gè)常用的內(nèi)參蛋白進(jìn)行講解。 1 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶） GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是在細(xì)胞代謝糖酵解中起關(guān)鍵作用的酶，由4個(gè)30-40kDa的亞基組成，檢測(cè)條帶大約在36kDa。 它的表達(dá)量通常較高，在相同的細(xì)胞或組織中的表達(dá)量比較恒定。但是在缺氧和糖尿病等疾病情況中，GAPDH表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化，因此在這些情況下不推薦作為內(nèi)參。 2 Actin（肌動(dòng)蛋白） Actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要蛋白之一。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-actin，檢測(cè)條帶大約在分子量42kDa。 它在許多真核細(xì)胞中都有廣泛且穩(wěn)定的表達(dá)，適用于全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)樣品。 3 Tubulin（微管蛋白） Tubulin是構(gòu)成微管網(wǎng)絡(luò)的重要蛋白。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-tubulin，檢測(cè)條帶大約在55 kDa。 微管蛋白與維持細(xì)胞形態(tài)和分裂過(guò)程有關(guān)，因此它的表達(dá)水平可能受細(xì)胞狀態(tài)變化的影響。抗生素和抗有絲分裂耐藥的細(xì)胞，Tubulin微管蛋白表達(dá)可能存在差異，即耐藥性研究可能不建議用Tubulin作為內(nèi)參蛋白。 以下是在挑選內(nèi)參的一些參考建議： 1 針對(duì)樣本而言 首先考慮樣品的物種來(lái)源、目的蛋白的表達(dá)部位例如全細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或者血清 、血漿樣本等。 哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或者組織樣本一般可選擇GAPDH、actin、tubulin（全細(xì)胞）、ATP1A1（細(xì)胞膜蛋白）、Histone H3（核蛋白）、Lamin（細(xì)胞核膜）、COX412（線粒體）、Albumin（全血、血漿、血清）作內(nèi)參。 而一些稀有物種具體需要通過(guò)查閱文獻(xiàn)選擇比較保守的管家基因作為蛋白內(nèi)參。 2 蛋白分子量選擇 a 原則上選擇的內(nèi)參與通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 KDa以上。 例如PTEN(47-55KDa)，此時(shí)內(nèi)參選擇GAPDH比較合適，NF-κb（65-70KDa）,此時(shí)β-actin較合適，GAPDH也可以。 另外，若是分子量為42-45kDa，此時(shí)不適宜選擇β-actin 作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或β-tubulin作為內(nèi)參。另外兩種內(nèi)參也是相同情況。 b 內(nèi)參和目的蛋白也不是相差越大越好 轉(zhuǎn)膜時(shí)間不好控制，若內(nèi)參太小，目的蛋白太大，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)參轉(zhuǎn)膜過(guò)度或者目的蛋白未完全轉(zhuǎn)上。此情況需要分開(kāi)轉(zhuǎn)膜。 保證穩(wěn)定性，內(nèi)參蛋白需要在不同樣本中穩(wěn)定表達(dá)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。如果內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平與目的蛋白相差過(guò)大，可能會(huì)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。 另外若是同時(shí)處理多個(gè)樣本，將目的蛋白和內(nèi)參分開(kāi)進(jìn)行檢測(cè)可以同時(shí)處理多個(gè)樣本，提高實(shí)驗(yàn)效率。如果內(nèi)參和目的蛋白的表達(dá)水平相差過(guò)大，可能需要調(diào)整上樣量和抗體濃度，這可能會(huì)降低實(shí)驗(yàn)效率。 3 細(xì)胞 、組織特異性 在選擇內(nèi)參時(shí)，在考量實(shí)驗(yàn)條件和研究背景下，不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康目赡苄枰煌膬?nèi)參。 例如我們?cè)谧龆嗉?xì)胞、多組織樣本或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本對(duì)比表達(dá)量時(shí)，GAPDH作為內(nèi)參是比較合適，因?yàn)镚APDH作為細(xì)胞代謝過(guò)程中 關(guān)鍵酶類蛋白，在組織中表達(dá)比較恒定。 而β-Actin和β-Tubulin是細(xì)胞骨架成分的 結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)有差異性。 4 內(nèi)參帶條齊、目的蛋白有趨勢(shì) 基本前提： 內(nèi)參選擇正確 上樣量一致 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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