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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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污染了，如何鑒定是什么壞東西干的？ 已有1人參與
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養(yǎng)細胞遭遇污染是一種非常常見的情況，如果一覺睡醒發(fā)現(xiàn)細胞周圍有許多黑色點點或桿狀不明物體在旋轉(zhuǎn)跳躍，那也差不多可以輕輕地閉上眼把整個瓶子都扔了。 1 總體思路 先說路線：分離 → 純化 → 鑒定 如果我們能確定污染物是一種細菌，即便肉眼可見有很多黑點，細菌的生物量很可能還是不比原本培養(yǎng)的細胞多。 那么，如何有效地將數(shù)量上可能占劣勢的細菌與大量動物細胞分離開，并進行純化與鑒定，就是核心難點。 在細胞培養(yǎng)污染這個場景中，制備送檢樣本比鑒定本身還要重要。 有一些比較老的教科書認為應該直接從培養(yǎng)物中取樣，用無菌生理鹽水進行稀釋，通過平板劃線或涂布稀釋培養(yǎng)獲取單個菌落，然后取單個菌落進行染色、生化、PCR等檢測。 但是，從培養(yǎng)物中分離細菌這一步的要點應該是如何把培養(yǎng)的細胞和細菌分開，直接稀釋做不到這一點，所以我們在中間增加了一些步驟。 另外，現(xiàn)在各種商品化試劑盒非常豐富，檢驗科的同學應該見過，類似下面這種試紙就可以快速鑒定是否屬于某些常見菌，PCR試劑盒種類也很多，所以鑒定這一塊也比較省事了。 a 分離與富集：將細菌從培養(yǎng)物中分離出來 這是最關(guān)鍵的一步，目標是最大程度地減少真核細胞的干擾，富集細菌。把有限的試劑用到細菌上。 細菌雖然也是細胞，但哺乳動物細胞（直徑~10-20 μm）比大多數(shù)細菌（直徑~0.5-5 μm）大得多，所以我們看到的往往是會動的黑點。 利用這一點，我們可以用一些比較便宜的方法進行初步分離與富集，避免在鑒定這一步花更多經(jīng)費。 這里有兩個物理方法：差速離心法和過濾法。 差速離心法 操作： 取少量被污染的培養(yǎng)物（1-2 mL）。 首先低速離心：首先低速離心以分離細胞與細菌。如以200 × g離心力離心5-10 min使培養(yǎng)的細胞形成松散的沉淀，而細菌大多依然懸浮在上清中。小心吸取含細菌的上清液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中。 其次高速離心：此時將上清以約10,000-15,000 × g的離心力離心 2-5 min，沉淀細菌。隨后棄上清。 用少量無菌生理鹽水或PBS重懸細菌沉淀。你得到的就是一個細菌已經(jīng)被顯著富集、而且細胞碎片干擾大大降低的樣品。 優(yōu)勢：多快好省，能有效去除大部分真核細胞。 過濾法 根據(jù)細菌和細胞的大小差異，選擇孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。 細菌（尤其是桿狀這種一條的）可以通過濾膜，而哺乳動物細胞則被截留。只需將污染培養(yǎng)物通過無菌過濾器，收集濾液即可。濾液中含有細菌，可用于后續(xù)涂布。 但需注意有些細菌長得比較大，又或是成簇的細菌、粘附在細胞上的細菌，這些塊頭比較大的個體可能被截留，造成漏檢。 如果原細胞培養(yǎng)液中含抗生素，細菌生長可能被抑制。此時最好還是離心一次，以去除含抗生素的上清，用無菌PBS洗滌沉淀。 b 純化：獲取單菌落 選擇性培養(yǎng) 在涂布平板前，根據(jù)獲得的細菌樣本量，可能還是要先簡單富集培養(yǎng)一下，以獲取更多的可用菌，或進一步分離。 可以考慮將樣品接種到細菌專用液體培養(yǎng)基（如實驗室里那瓶引人注目的“LB肉湯”）中，在適宜溫度（可以直接設置37°C）下震蕩培養(yǎng)幾小時。 原本培養(yǎng)的細胞一般不會很喜歡這種沒有血清又不是貼身設計的培養(yǎng)基，可以達到一定富集、純化活菌的效果。 獲取單菌落 然后進入不必多言的教科書傳統(tǒng)方法環(huán)節(jié)： 平板劃線法 涂布平板法 然后將平板倒置于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天。有長勢喜人的菌落后，挑取形態(tài)單一、特征明顯的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，確認是否為純培養(yǎng)物。 c 鑒定：鑒定細菌物種 作為第一步的革蘭氏染色 除了記錄細菌形態(tài)（球菌/桿菌/螺旋菌等基礎分類）外，可以考慮首先進行革蘭氏染色，以將后續(xù)鑒定限制在一個范圍內(nèi)，節(jié)省精力資源。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務內(nèi)容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學、天然產(chǎn)物 |
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