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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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浪費時間且耗費試劑，ELISA實驗為什么要做預(yù)實驗?zāi)兀?
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為什么要做預(yù)實驗？？？ 01 熟悉實驗操作 不同的商業(yè)化的試劑盒產(chǎn)品，對于操作細(xì)節(jié)都會有所差異。比如試劑盒的溫育溫度，有些是4度，有些是常溫，還有些需要在37度恒溫條件下反應(yīng)。使用商業(yè)化的試劑盒，需要嚴(yán)格按照試劑盒的說明書要求完成實驗，不要因為操作步驟與平時的實驗習(xí)慣不同，就隨意改變說明書中的操作，導(dǎo)致不理想的實驗結(jié)果。在正式實驗之前，熟悉下整體實驗操作流程是有必要的。 02 優(yōu)化實驗方案 做預(yù)實驗時，可以記錄下使用過程中出現(xiàn)的疑問，得到結(jié)果后，進行總結(jié)分析，并可聯(lián)系試劑盒廠家的技術(shù)人員給出建議，確保正式實驗有序進行。 預(yù)測樣本量，確定 樣本最適稀釋倍數(shù) 商業(yè)化的試劑盒在出廠驗證時，會測定不同種類的樣本，確定試劑盒測樣的有效性。通常，對于成分穩(wěn)定的血清血漿樣本，可根據(jù)說明書中推薦的稀釋倍數(shù)完成實驗。另外，由于試劑盒廠家獲取樣本的渠道有限，一般只能驗證正常個體的血清血漿樣本，而某些靶標(biāo)物在疾病、服用藥物等生理狀態(tài)下，表達量也會不同，這種情況下，也需要通過預(yù)試驗確定樣本最適稀釋倍數(shù)后，再進行大量樣本的測定。 不同于血清血漿，有些樣本存在諸多影響靶標(biāo)物含量的干擾因素，如：組織樣本的干擾因素包括：組織類型、提取方式、刺激處理方式等；細(xì)胞樣本的干擾因素包括：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時間、刺激處理方式等；尿液&唾液&乳汁樣本的干擾因素包括：飲水量、采樣時間、采樣方式等。這些干擾因素均會直接影響樣本中靶標(biāo)物的濃度，建議實驗前先通過預(yù)試驗，預(yù)測樣本中靶標(biāo)物的含量，確定樣本最適稀釋倍數(shù)，再進行正式實驗。還有一些特殊樣本，如：陰道灌洗液、精液、齦溝液，試劑盒生產(chǎn)廠家不易獲取，也不會用于試劑盒的驗證，且相關(guān)的研究報道不多，這類樣本也有必要先做預(yù)試驗，摸索合適的樣本稀釋倍數(shù)，再開展正式實驗 顯然，預(yù)試驗不僅不會造成試劑和樣本的浪費，用少量的樣本和試劑完成預(yù)試驗確保正式實驗大量樣本的測定能夠有序進行，經(jīng)濟且省時省力。 如何設(shè)計ELISA預(yù)實驗？？？ 01 實驗樣本的選擇 預(yù)實驗一般通過測定少數(shù)有代表性的樣本來確定正式實驗方案。如何選擇有代表性的樣本開展預(yù)實驗?zāi)�？通常，測定的樣本會分為不同的組別，不同組別的樣本由于前期處理or刺激后，靶標(biāo)物的表達量會產(chǎn)生變化，建議從各組樣本中隨機選擇1-2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數(shù)量多，分配到預(yù)實驗的試劑量有限，那么至少選擇兩例樣品，建議選用1例為理論上靶標(biāo)物含量最低組的樣品，另1例為理論上靶標(biāo)物含量最高組的樣品。 02 最適稀釋倍數(shù)的確定 將樣本梯度稀釋，可根據(jù)樣本中靶標(biāo)物的濃度，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋，同時測定標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的制備需按照試劑盒說明書的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的標(biāo)曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點（如空白孔、最低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔）。將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的O.D.值與梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品O.D.值進行對比，最佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部/絕大多數(shù)樣本O.D.值能夠位于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度孔對應(yīng)的O.D.值，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳擬合區(qū)域。需要注意的是在做預(yù)實驗時，一定要設(shè)置標(biāo)曲，不設(shè)置標(biāo)曲，就如同在丈量時沒有尺一樣，無法通過比較確定最適稀釋倍數(shù)。 03 顯色時間的確定 顯色是ELISA實驗中最后一步溫育反應(yīng)，固定在酶標(biāo)板上的酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。由于ELISA實驗會受到環(huán)境差異及實驗操作差異的影響，商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間，而是建議實驗操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應(yīng)時間。加入底物后可定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（如每隔5分鐘觀察一次），當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止。通過預(yù)實驗熟悉操作的同時，也能確定合適的顯色時間。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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