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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
浪費時間且耗費試劑，ELISA實驗為什么要做預實驗呢？
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為什么要做預實驗？？？ 01 熟悉實驗操作 不同的商業(yè)化的試劑盒產(chǎn)品，對于操作細節(jié)都會有所差異。比如試劑盒的溫育溫度，有些是4度，有些是常溫，還有些需要在37度恒溫條件下反應。使用商業(yè)化的試劑盒，需要嚴格按照試劑盒的說明書要求完成實驗，不要因為操作步驟與平時的實驗習慣不同，就隨意改變說明書中的操作，導致不理想的實驗結(jié)果。在正式實驗之前，熟悉下整體實驗操作流程是有必要的。 02 優(yōu)化實驗方案 做預實驗時，可以記錄下使用過程中出現(xiàn)的疑問，得到結(jié)果后，進行總結(jié)分析，并可聯(lián)系試劑盒廠家的技術(shù)人員給出建議，確保正式實驗有序進行。 預測樣本量，確定 樣本最適稀釋倍數(shù) 商業(yè)化的試劑盒在出廠驗證時，會測定不同種類的樣本，確定試劑盒測樣的有效性。通常，對于成分穩(wěn)定的血清血漿樣本，可根據(jù)說明書中推薦的稀釋倍數(shù)完成實驗。另外，由于試劑盒廠家獲取樣本的渠道有限，一般只能驗證正常個體的血清血漿樣本，而某些靶標物在疾病、服用藥物等生理狀態(tài)下，表達量也會不同，這種情況下，也需要通過預試驗確定樣本最適稀釋倍數(shù)后，再進行大量樣本的測定。 不同于血清血漿，有些樣本存在諸多影響靶標物含量的干擾因素，如：組織樣本的干擾因素包括：組織類型、提取方式、刺激處理方式等；細胞樣本的干擾因素包括：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間、刺激處理方式等；尿液&唾液&乳汁樣本的干擾因素包括：飲水量、采樣時間、采樣方式等。這些干擾因素均會直接影響樣本中靶標物的濃度，建議實驗前先通過預試驗，預測樣本中靶標物的含量，確定樣本最適稀釋倍數(shù)，再進行正式實驗。還有一些特殊樣本，如：陰道灌洗液、精液、齦溝液，試劑盒生產(chǎn)廠家不易獲取，也不會用于試劑盒的驗證，且相關(guān)的研究報道不多，這類樣本也有必要先做預試驗，摸索合適的樣本稀釋倍數(shù)，再開展正式實驗 顯然，預試驗不僅不會造成試劑和樣本的浪費，用少量的樣本和試劑完成預試驗確保正式實驗大量樣本的測定能夠有序進行，經(jīng)濟且省時省力。 如何設(shè)計ELISA預實驗？？？ 01 實驗樣本的選擇 預實驗一般通過測定少數(shù)有代表性的樣本來確定正式實驗方案。如何選擇有代表性的樣本開展預實驗呢？通常，測定的樣本會分為不同的組別，不同組別的樣本由于前期處理or刺激后，靶標物的表達量會產(chǎn)生變化，建議從各組樣本中隨機選擇1-2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數(shù)量多，分配到預實驗的試劑量有限，那么至少選擇兩例樣品，建議選用1例為理論上靶標物含量最低組的樣品，另1例為理論上靶標物含量最高組的樣品。 02 最適稀釋倍數(shù)的確定 將樣本梯度稀釋，可根據(jù)樣本中靶標物的濃度，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋，同時測定標準品。標準品的制備需按照試劑盒說明書的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的標曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點（如空白孔、最低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔）。將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的O.D.值與梯度濃度標準品O.D.值進行對比，最佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部/絕大多數(shù)樣本O.D.值能夠位于標準曲線中間濃度孔對應的O.D.值，即標準曲線的最佳擬合區(qū)域。需要注意的是在做預實驗時，一定要設(shè)置標曲，不設(shè)置標曲，就如同在丈量時沒有尺一樣，無法通過比較確定最適稀釋倍數(shù)。 03 顯色時間的確定 顯色是ELISA實驗中最后一步溫育反應，固定在酶標板上的酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。由于ELISA實驗會受到環(huán)境差異及實驗操作差異的影響，商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間，而是建議實驗操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應時間。加入底物后可定時觀察反應孔的顏色變化（如每隔5分鐘觀察一次），當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止。通過預實驗熟悉操作的同時，也能確定合適的顯色時間。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務內(nèi)容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學、天然產(chǎn)物 |
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