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[交流]
大家做親和層析柱的時(shí)候，有沒(méi)有遇到過(guò)載量突然下降或者非特異吸附特別兇的情況？
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蟲(chóng)友們好，最近在實(shí)驗(yàn)室純化蛋白，又被親和層析柱給折騰得不輕，心里一堆問(wèn)號(hào)，實(shí)在憋不住想上來(lái)跟大家嘮嘮，看看有沒(méi)有同病相憐或者有高見(jiàn)的朋友。 我用的就是最常見(jiàn)的那種鎳柱，純化帶His標(biāo)簽的蛋白，方法也是老套路了。但最近這根柱子明顯感覺(jué)“體力不支”，上樣量沒(méi)變，但流穿里的目標(biāo)蛋白越來(lái)越多，感覺(jué)載量唰唰往下掉，心都在滴血啊。這還不是最頭疼的，更煩的是雜蛋白粘得那叫一個(gè)結(jié)實(shí)，洗脫的時(shí)候跟著目標(biāo)蛋白一起下來(lái)，純度簡(jiǎn)直沒(méi)眼看。我就在那兒琢磨，這親和層析柱的脾氣到底該怎么摸透？ 我自個(gè)兒瞎分析了一下，感覺(jué)可能性太多了，腦子有點(diǎn)亂。比如柱子壽命，是不是反復(fù)再生太多次，填料里的配基（像鎳離子）脫落了？或者上樣樣品沒(méi)處理好，雖然離心過(guò)濾了，但會(huì)不會(huì)有些細(xì)胞碎片或者油脂樣的東西偷偷把填料孔給堵了、包住了？還有樣品緩沖液的條件，pH、離子強(qiáng)度甚至還原劑啥的，是不是悄悄改變了蛋白和配基的“親和力”？有時(shí)候甚至懷疑，蛋白自己會(huì)不會(huì)形成二聚體或者多聚體，把標(biāo)簽給藏起來(lái)了，導(dǎo)致柱子抓不住？ 另外，非特異吸附這個(gè)老大難，大家一般怎么破？我試過(guò)在緩沖液里加點(diǎn)低濃度的咪唑或者NaCl，有時(shí)候管用，有時(shí)候又感覺(jué)效果不明顯。是不是不同蛋白的性子差別太大，都得一點(diǎn)點(diǎn)摸條件？還有，柱子保存和維護(hù)，大家有沒(méi)有什么特別順手的小技巧？比如怕長(zhǎng)菌，但殺菌劑會(huì)不會(huì)傷柱子？ 總之，感覺(jué)親和層析柱這東西吧，用起來(lái)原理好像挺直接，但真想讓它穩(wěn)定高效地工作，里頭細(xì)節(jié)太多了，稍不注意就給你點(diǎn)顏色看看。特別想知道大家在實(shí)際操作中，有沒(méi)有總結(jié)出什么實(shí)用的經(jīng)驗(yàn)或者踩過(guò)哪些坑？比如有沒(méi)有什么跡象能提前判斷柱子狀態(tài)不行了？或者遇到我這種問(wèn)題，你們的排查順序一般是啥樣的？ 純粹是技術(shù)討論，求大佬們分享點(diǎn)心得，救救孩子吧，一起交流學(xué)習(xí)才能少走彎路啊！ |
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