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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
導致蛋白質沉淀/聚集的關鍵因素 已有2人參與
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物理因素：蛋白質的天敵 ️ 最常見的物理因素！溫度絕對是頭號殺手記得我上個月辛辛苦苦純化的IL-2蛋白嗎？放在實驗室臺面上忘記及時放回4℃冰箱，兩小時后回來就看到溶液變得渾濁，簡直想哭 高溫會增加蛋白分子的動能，促使其暴露內部疏水基團，進而形成無規(guī)則聚集體。 還有一個反復傷害我的就是凍融循環(huán)上上周取樣分析，一支珍貴的抗體反復從-80℃拿出來又放回去，到第三次時已經出現(xiàn)了明顯的微粒。凍融過程中形成的冰晶會對蛋白質結構造成機械損傷，每凍一次，損傷就累積一分！ 另外大家別忘了剪切力的影響！我曾經為了快速溶解一支濃縮蛋白，用力搖晃、甚至用漩渦混勻器高速震蕩，結果產生大量泡沫，回頭一看，蛋白活性只剩原來的30%了 這是因為剪切力和氣-液界面會導致蛋白質展開變性。 最后是濃度過高的問題，有次為了提高產量，我將重組GPCRs蛋白濃縮到8mg/ml，結果第二天來一看，全變成了果凍狀 高濃度時蛋白分子間相互作用的機會大大增加，特別是對于那些表面疏水區(qū)域多的蛋白！ 化學因素：細微變化，巨大影響 pH值變化簡直是蛋白質的噩夢！記得有一次我的緩沖液配錯了，pH偏離了最佳值1.5個單位，我的激酶蛋白立刻就出現(xiàn)了絮狀沉淀因為pH會改變蛋白表面電荷分布，影響其溶解度和構象穩(wěn)定性。 離子強度波動也是個隱形殺手 曾經我按照文獻將純化好的蛋白透析到低鹽緩沖液中，想著"低鹽肯定好啊"，結果第二天一看，全部沉底了！某些蛋白需要一定的鹽濃度來屏蔽表面電荷，維持溶解狀態(tài)。 錯誤的緩沖液組分也是災難源頭 去年我用Tris緩沖液保存一個含有大量賴氨酸殘基的蛋白，兩天后發(fā)現(xiàn)大量沉淀——原來Tris會與這些賴氨酸殘基發(fā)生反應。后來改用PBS，問題立刻解決！ 還有氧化還原環(huán)境變化 一個含有多個半胱氨酸的轉錄因子，我沒有及時加入DTT，讓它暴露在空氣中過夜，第二天發(fā)現(xiàn)形成了大量二硫鍵交聯(lián)的聚合物。 生物因素：蛋白自身的"性格"問題 有些蛋白天生就有"社交恐懼癥"，比如我研究的一種膜蛋白，無論怎么優(yōu)化條件，離開了脂質環(huán)境就開始聚集 這完全是由于其高度疏水的跨膜區(qū)域決定的。 翻譯后修飾缺失也是常見原因。有次我們在大腸桿菌中表達一個需要糖基化的人源蛋白，純化后總是形成包涵體，后來才發(fā)現(xiàn)沒有正確的糖基化修飾，蛋白就無法保持正確折疊。 最可怕的是蛋白酶污染！上個季度我有一支蛋白樣品被微量蛋白酶污染，過夜后不但沉淀，還失去了全部活性 那些被部分降解的片段往往會暴露出原本隱藏的疏水區(qū)域，引發(fā)大規(guī)模聚集。 操作因素：人為失誤最心痛 純化過程中的錯誤操作簡直是家常便飯...記得我有次急著下班，忘記調整洗脫緩沖液的pH，結果第二天的樣品全部混濁。另一次是我急于得到結果，將蛋白從凝膠過濾柱上快速洗脫，結果造成局部高剪切力，導致蛋白大量失活沉淀。 儲存條件不當也是大忌！我最心痛的一次是將價值不菲的抗體放在實驗室窗臺邊，被陽光直射了整個下午，回來時已經變成了一堆"豆腐渣" 紫外線導致蛋白質內部氨基酸殘基光氧化，破壞了整體結構。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務內容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關、生命科學、天然產物 |
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