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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀/聚集的關(guān)鍵因素 已有2人參與
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物理因素：蛋白質(zhì)的天敵 ️ 最常見的物理因素！溫度絕對(duì)是頭號(hào)殺手記得我上個(gè)月辛辛苦苦純化的IL-2蛋白嗎？放在實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面上忘記及時(shí)放回4℃冰箱，兩小時(shí)后回來就看到溶液變得渾濁，簡直想哭 高溫會(huì)增加蛋白分子的動(dòng)能，促使其暴露內(nèi)部疏水基團(tuán)，進(jìn)而形成無規(guī)則聚集體。 還有一個(gè)反復(fù)傷害我的就是凍融循環(huán)上上周取樣分析，一支珍貴的抗體反復(fù)從-80℃拿出來又放回去，到第三次時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的微粒。凍融過程中形成的冰晶會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成機(jī)械損傷，每凍一次，損傷就累積一分！ 另外大家別忘了剪切力的影響！我曾經(jīng)為了快速溶解一支濃縮蛋白，用力搖晃、甚至用漩渦混勻器高速震蕩，結(jié)果產(chǎn)生大量泡沫，回頭一看，蛋白活性只剩原來的30%了 這是因?yàn)榧羟辛蜌?液界面會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)展開變性。 最后是濃度過高的問題，有次為了提高產(chǎn)量，我將重組GPCRs蛋白濃縮到8mg/ml，結(jié)果第二天來一看，全變成了果凍狀 高濃度時(shí)蛋白分子間相互作用的機(jī)會(huì)大大增加，特別是對(duì)于那些表面疏水區(qū)域多的蛋白！ 化學(xué)因素：細(xì)微變化，巨大影響 pH值變化簡直是蛋白質(zhì)的噩夢(mèng)！記得有一次我的緩沖液配錯(cuò)了，pH偏離了最佳值1.5個(gè)單位，我的激酶蛋白立刻就出現(xiàn)了絮狀沉淀因?yàn)閜H會(huì)改變蛋白表面電荷分布，影響其溶解度和構(gòu)象穩(wěn)定性。 離子強(qiáng)度波動(dòng)也是個(gè)隱形殺手 曾經(jīng)我按照文獻(xiàn)將純化好的蛋白透析到低鹽緩沖液中，想著"低鹽肯定好啊"，結(jié)果第二天一看，全部沉底了！某些蛋白需要一定的鹽濃度來屏蔽表面電荷，維持溶解狀態(tài)。 錯(cuò)誤的緩沖液組分也是災(zāi)難源頭 去年我用Tris緩沖液保存一個(gè)含有大量賴氨酸殘基的蛋白，兩天后發(fā)現(xiàn)大量沉淀——原來Tris會(huì)與這些賴氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)。后來改用PBS，問題立刻解決！ 還有氧化還原環(huán)境變化 一個(gè)含有多個(gè)半胱氨酸的轉(zhuǎn)錄因子，我沒有及時(shí)加入DTT，讓它暴露在空氣中過夜，第二天發(fā)現(xiàn)形成了大量二硫鍵交聯(lián)的聚合物。 生物因素：蛋白自身的"性格"問題 有些蛋白天生就有"社交恐懼癥"，比如我研究的一種膜蛋白，無論怎么優(yōu)化條件，離開了脂質(zhì)環(huán)境就開始聚集 這完全是由于其高度疏水的跨膜區(qū)域決定的。 翻譯后修飾缺失也是常見原因。有次我們?cè)诖竽c桿菌中表達(dá)一個(gè)需要糖基化的人源蛋白，純化后總是形成包涵體，后來才發(fā)現(xiàn)沒有正確的糖基化修飾，蛋白就無法保持正確折疊。 最可怕的是蛋白酶污染！上個(gè)季度我有一支蛋白樣品被微量蛋白酶污染，過夜后不但沉淀，還失去了全部活性 那些被部分降解的片段往往會(huì)暴露出原本隱藏的疏水區(qū)域，引發(fā)大規(guī)模聚集。 操作因素：人為失誤最心痛 純化過程中的錯(cuò)誤操作簡直是家常便飯...記得我有次急著下班，忘記調(diào)整洗脫緩沖液的pH，結(jié)果第二天的樣品全部混濁。另一次是我急于得到結(jié)果，將蛋白從凝膠過濾柱上快速洗脫，結(jié)果造成局部高剪切力，導(dǎo)致蛋白大量失活沉淀。 儲(chǔ)存條件不當(dāng)也是大忌！我最心痛的一次是將價(jià)值不菲的抗體放在實(shí)驗(yàn)室窗臺(tái)邊，被陽光直射了整個(gè)下午，回來時(shí)已經(jīng)變成了一堆"豆腐渣" 紫外線導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸殘基光氧化，破壞了整體結(jié)構(gòu)。 畢合生物(www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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