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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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實(shí)驗(yàn)技術(shù)干貨 | Transwell 操作標(biāo)準(zhǔn)化流程及避坑指南
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一、實(shí)驗(yàn)原理Transwell 實(shí)驗(yàn)的核心在于通過多孔膜裝置模擬體內(nèi)細(xì)胞穿越組織屏障的生理過程，常用于研究細(xì)胞遷移、趨化性和侵襲能力。其原理關(guān)鍵要點(diǎn)如下： •裝置構(gòu)成：由 Transwell 小室（含滲透膜）和孔板組成，膜上小孔直徑通常為 0.1 - 12μm（根據(jù)細(xì)胞類型選擇，如腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)常用 8μm 孔徑）。 •細(xì)胞運(yùn)動(dòng)邏輯：上室接種細(xì)胞，下室放置化學(xué)引誘劑（如 FBS、生長因子）形成濃度梯度，細(xì)胞感知刺激后通過偽足伸展、細(xì)胞骨架重構(gòu)等方式穿過膜孔遷移至下室。 •生理意義：遷移實(shí)驗(yàn)可研究細(xì)胞在無基質(zhì)膠情況下的遷移能力（如炎癥細(xì)胞向趨化因子的移動(dòng)）；侵襲實(shí)驗(yàn)則在膜上預(yù)鋪基質(zhì)膠（模擬細(xì)胞外基質(zhì)），評估細(xì)胞突破屏障的能力（如腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移）。 二、實(shí)驗(yàn) Tips 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備環(huán)節(jié)：桌面用 75% 酒精擦拭，器材提前滅菌（如小室、槍頭），避免污染影響細(xì)胞活性； 固定染色環(huán)節(jié)：多聚甲醛固定前先洗去培養(yǎng)基殘留，結(jié)晶紫染色后可不洗直接擦細(xì)胞，減少雜質(zhì)干擾； 棉簽操作環(huán)節(jié)：擦拭上室細(xì)胞時(shí)力度輕柔，沿一個(gè)方向擦拭（避免來回摩擦導(dǎo)致膜孔堵塞），防止破壞膜結(jié)構(gòu)； 拍照記錄環(huán)節(jié)：務(wù)必拍到膜孔結(jié)構(gòu)，標(biāo)注放大倍數(shù)和視野位置，增強(qiáng)結(jié)果真實(shí)性。 三、常見問題解決 遷移細(xì)胞過少：可能因細(xì)胞濃度過低、趨化因子濃度不足或培養(yǎng)時(shí)間過短，需優(yōu)化濃度梯度和時(shí)間； 背景染色深：多聚甲醛固定后清洗不徹底，或結(jié)晶紫染色時(shí)間過長，需縮短染色時(shí)間并充分洗去多余染料。 四、 Transwell 小室操作 1. 細(xì)胞懸液制備 消化細(xì)胞后，無血清培養(yǎng)基洗 3 次（去除血清中的生長因子干擾），計(jì)數(shù)后配置成 2×10⁵/ml 懸液（首次實(shí)驗(yàn)需摸索最佳細(xì)胞濃度，如 2 - 5×10⁴細(xì)胞 / 小室）。 2. 上室與下室接種 上室加入 100μl 細(xì)胞懸液（含 2×10⁴細(xì)胞），下室加入 600μl 含 20% FBS 的完全培養(yǎng)基（FBS 作為趨化因子誘導(dǎo)遷移）。 ⚠ 關(guān)鍵細(xì)節(jié)：上室加樣時(shí)避免氣泡，下室液體需覆蓋膜底部，確保濃度梯度有效形成。 五、培養(yǎng)與染色 1. 孵育與固定染色 37℃、5% CO₂ 孵育 48 小時(shí)（首次實(shí)驗(yàn)需測試 24 - 72 小時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)，觀察遷移效率）。取出小室，PBS 洗 2 次，4% 多聚甲醛固定 30 分鐘，結(jié)晶紫（無需稀釋）染色 30 分鐘，再用 PBS 洗 2 次。 ✅操作技巧：用棉簽輕擦上室未遷移細(xì)胞時(shí)，小室內(nèi)保留少量 PBS，避免膜干燥或破損。 2. 拍照與觀察 將小室置于載玻片上，倒置顯微鏡下用 10× 或 20× 物鏡拍照，按從左到右順序采集多個(gè)視野（如每孔拍 5 個(gè)視野），確保覆蓋膜的不同區(qū)域。 六、小室清洗 清洗流程 ddH₂O 浸泡 24 小時(shí)，75% 酒精浸泡消毒，紫外線照射 30 分鐘，晾干后密封保存（適用于可重復(fù)使用的小室）。 |
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