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科研戰(zhàn)神來(lái)了新蟲 (小有名氣)
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免疫組化和免疫熒光（冰凍切片與石蠟切片）的區(qū)別
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免疫組化和免疫熒光都是本質(zhì)都是基于 “抗原 - 抗體特異性結(jié)合” 的原理對(duì)組織或細(xì)胞中的特定抗原進(jìn)行檢測(cè)和定位的技術(shù)。01免疫組化的原理免疫組化基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，再通過(guò)標(biāo)記物的顯色反應(yīng)，將組織或細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)抗原 可視化，實(shí)現(xiàn)定位、定性和相對(duì)定量分析，這個(gè)過(guò)程通過(guò)直接在特異性抗體上連接顯色標(biāo)記物，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等，也就是我們所說(shuō)的直接法，直接法雖然方法步驟簡(jiǎn)單，但是信號(hào)較弱。另外就是間接法，先使用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與抗原結(jié)合，再使用能識(shí)別一抗的 “二抗”，且二抗上連接了顯色標(biāo)記物。在間接法中，一個(gè)抗原可結(jié)合多個(gè)一抗，一個(gè)一抗又可結(jié)合多個(gè)二抗，相當(dāng)于將初始信號(hào)放大，讓最終顯色更清晰，這也是目前更常用的方法。 02免疫熒光的原理免疫熒光則是基于抗原 - 抗體特異性結(jié)合與熒光標(biāo)記技術(shù)的結(jié)合，通過(guò)熒光信號(hào)將組織或細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)抗原直可視化。同樣也分直接法和間接法，直接法就是直接將將熒光素（如 FITC、Cy3）標(biāo)記在特異性一抗上。一抗與抗原結(jié)合后，熒光素便直接標(biāo)記目標(biāo)抗原上。該方法步驟簡(jiǎn)單，但信號(hào)較弱，適用范圍較窄。間接法則是先讓未標(biāo)記的一抗與抗原結(jié)合，再使用能識(shí)別一抗的 “二抗”，且二抗上預(yù)先標(biāo)記了熒光素。由于一個(gè)一抗可結(jié)合多個(gè)二抗，能放大熒光信號(hào)，靈敏度更高，也是目前更常用的方法。 03冰凍切片和石蠟切片冰凍切片的制作過(guò)程：將預(yù)處理后的組織塊放入包埋盒，加入 OCT 包埋劑。OCT 能固定組織形態(tài)，減少冰晶產(chǎn)生，并幫助組織與載物臺(tái)貼合。將包埋好的組織放入冰凍切片機(jī)的冷凍室，設(shè)置溫度為 -15℃至 - 25℃。不同組織冷凍溫度不同，等到組織完全冷凍硬化，即可開始切片。石蠟切片的制作過(guò)程包括：1. 組織取材與固定2. 脫水與透明3. 浸蠟與包埋4. 切片與貼片，步驟相對(duì)于冰凍切片來(lái)說(shuō)較為繁瑣冰凍切片和石蠟切片的優(yōu)缺點(diǎn)：冰凍切片能較好保留組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)無(wú)需進(jìn)行抗原修復(fù)步驟。要是檢測(cè)翻譯后修飾，比如磷酸化，用冰凍切片會(huì)更有助于檢測(cè)。缺點(diǎn)就是細(xì)胞里容易形成冰晶，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致抗原擴(kuò)散。石蠟切片能維持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，能夠在室溫下保存。而冰凍切片就比較麻煩，必須存放在 - 80 度的低溫冰箱里。由于石蠟切片能切到 4μm 左右的厚度，所以切出來(lái)的片子在顏色、形態(tài)上都比冰凍切片好。另外，我們?cè)谫?gòu)買一抗的時(shí)候，產(chǎn)品應(yīng)用說(shuō)明會(huì)標(biāo)注適用的切片類型。要是說(shuō)明寫著只能用于冰凍切片，那就不能用石蠟切片；要是寫著兩者都能用，那兩種切片都可以用來(lái)做實(shí)驗(yàn)。04為什么冰凍切片不需要做抗原修復(fù)？冰凍切片對(duì)組織抗原影響小在冰凍切片制作時(shí)，組織主要經(jīng)歷快速冷凍和低溫切片步驟。新鮮組織迅速被置于低溫環(huán)境中冷凍，整個(gè)過(guò)程沒(méi)有經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的化學(xué)試劑處理和高溫過(guò)程。所以使得組織內(nèi)抗原的空間結(jié)構(gòu)得以較好地保留，抗原決定簇沒(méi)有被封閉或破壞，抗體能夠直接與抗原結(jié)合 ，所以不需要進(jìn)行抗原修復(fù)步驟，就可以直接進(jìn)行免疫組化染色等后續(xù)操作。石蠟切片對(duì)組織抗原影響大而在石蠟切片制作過(guò)程中，組織需要經(jīng)過(guò)固定（如福爾馬林，甲醛固定）、脫水、透明和浸蠟等步驟。固定劑（如甲醛）會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，形成醛鍵 ，從而封閉抗原決定簇，阻礙抗體與抗原的結(jié)合。此外在浸蠟和包埋步驟中，組織需要在相對(duì)較高的溫度下進(jìn)行處理，高溫也可能會(huì)導(dǎo)致抗原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步降低抗原的免疫活性。由于石蠟切片的制作過(guò)程對(duì)組織抗原造成了較大影響，使得大部分抗原決定簇被封閉或抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，無(wú)法與抗體正常結(jié)合。因此，在進(jìn)行免疫組化染色前，必須通過(guò)抗原修復(fù)的方法，如高溫高壓、酶消化等，打開交聯(lián)的醛鍵，恢復(fù)抗原決定簇的空間結(jié)構(gòu)，暴露抗原表位，這樣才能使抗體與抗原順利結(jié)合，完成后續(xù)的免疫組化檢測(cè)。 |
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