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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
免疫組化和免疫熒光（冰凍切片與石蠟切片）的區(qū)別
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免疫組化和免疫熒光都是本質都是基于 “抗原 - 抗體特異性結合” 的原理對組織或細胞中的特定抗原進行檢測和定位的技術。01免疫組化的原理免疫組化基于抗原與抗體的特異性結合，再通過標記物的顯色反應，將組織或細胞內的目標抗原 可視化，實現(xiàn)定位、定性和相對定量分析，這個過程通過直接在特異性抗體上連接顯色標記物，如辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等，也就是我們所說的直接法，直接法雖然方法步驟簡單，但是信號較弱。另外就是間接法，先使用未標記的特異性抗體（一抗）與抗原結合，再使用能識別一抗的 “二抗”，且二抗上連接了顯色標記物。在間接法中，一個抗原可結合多個一抗，一個一抗又可結合多個二抗，相當于將初始信號放大，讓最終顯色更清晰，這也是目前更常用的方法。 02免疫熒光的原理免疫熒光則是基于抗原 - 抗體特異性結合與熒光標記技術的結合，通過熒光信號將組織或細胞內的目標抗原直可視化。同樣也分直接法和間接法，直接法就是直接將將熒光素（如 FITC、Cy3）標記在特異性一抗上。一抗與抗原結合后，熒光素便直接標記目標抗原上。該方法步驟簡單，但信號較弱，適用范圍較窄。間接法則是先讓未標記的一抗與抗原結合，再使用能識別一抗的 “二抗”，且二抗上預先標記了熒光素。由于一個一抗可結合多個二抗，能放大熒光信號，靈敏度更高，也是目前更常用的方法。 03冰凍切片和石蠟切片冰凍切片的制作過程：將預處理后的組織塊放入包埋盒，加入 OCT 包埋劑。OCT 能固定組織形態(tài)，減少冰晶產(chǎn)生，并幫助組織與載物臺貼合。將包埋好的組織放入冰凍切片機的冷凍室，設置溫度為 -15℃至 - 25℃。不同組織冷凍溫度不同，等到組織完全冷凍硬化，即可開始切片。石蠟切片的制作過程包括：1. 組織取材與固定2. 脫水與透明3. 浸蠟與包埋4. 切片與貼片，步驟相對于冰凍切片來說較為繁瑣冰凍切片和石蠟切片的優(yōu)缺點：冰凍切片能較好保留組織的抗原免疫活性，做免疫組化時無需進行抗原修復步驟。要是檢測翻譯后修飾，比如磷酸化，用冰凍切片會更有助于檢測。缺點就是細胞里容易形成冰晶，破壞細胞結構，可能導致抗原擴散。石蠟切片能維持組織細胞的形態(tài)結構，能夠在室溫下保存。而冰凍切片就比較麻煩，必須存放在 - 80 度的低溫冰箱里。由于石蠟切片能切到 4μm 左右的厚度，所以切出來的片子在顏色、形態(tài)上都比冰凍切片好。另外，我們在購買一抗的時候，產(chǎn)品應用說明會標注適用的切片類型。要是說明寫著只能用于冰凍切片，那就不能用石蠟切片；要是寫著兩者都能用，那兩種切片都可以用來做實驗。04為什么冰凍切片不需要做抗原修復？冰凍切片對組織抗原影響小在冰凍切片制作時，組織主要經(jīng)歷快速冷凍和低溫切片步驟。新鮮組織迅速被置于低溫環(huán)境中冷凍，整個過程沒有經(jīng)歷長時間的化學試劑處理和高溫過程。所以使得組織內抗原的空間結構得以較好地保留，抗原決定簇沒有被封閉或破壞，抗體能夠直接與抗原結合 ，所以不需要進行抗原修復步驟，就可以直接進行免疫組化染色等后續(xù)操作。石蠟切片對組織抗原影響大而在石蠟切片制作過程中，組織需要經(jīng)過固定（如福爾馬林，甲醛固定）、脫水、透明和浸蠟等步驟。固定劑（如甲醛）會使蛋白質發(fā)生交聯(lián)，形成醛鍵 ，從而封閉抗原決定簇，阻礙抗體與抗原的結合。此外在浸蠟和包埋步驟中，組織需要在相對較高的溫度下進行處理，高溫也可能會導致抗原的空間結構發(fā)生改變，進一步降低抗原的免疫活性。由于石蠟切片的制作過程對組織抗原造成了較大影響，使得大部分抗原決定簇被封閉或抗原結構發(fā)生變化，無法與抗體正常結合。因此，在進行免疫組化染色前，必須通過抗原修復的方法，如高溫高壓、酶消化等，打開交聯(lián)的醛鍵，恢復抗原決定簇的空間結構，暴露抗原表位，這樣才能使抗體與抗原順利結合，完成后續(xù)的免疫組化檢測。 |
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