 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 617 | 回復(fù): 0 | |||
科研戰(zhàn)神來(lái)了新蟲(chóng) (小有名氣)
|
[交流]
RNA濃度測(cè)定及反轉(zhuǎn)錄詳細(xì)步驟
|
| 前面我們介紹了RNA提取的步驟Trizol法提取RNA原理及詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟，提取得到的RNA使用DEPC水進(jìn)行溶解后，用Nanodrop進(jìn)行RNA濃度的檢測(cè)。1Nanodrop檢測(cè)RNA濃度的實(shí)驗(yàn)步驟 ①打開(kāi) Nanodrop 儀器電源，選擇檢測(cè)樣本的類(lèi)型②測(cè)試前先進(jìn)行基座清潔：用移液器吸取2μl蒸餾水加到檢測(cè)基座上，將樣品臂放下，浸泡2-3分鐘，用無(wú)塵紙將檢測(cè)基座擦拭干凈。③調(diào)零：清潔基座后，在下探頭上加2μl DEPC（使用與樣品對(duì)應(yīng)的溶液，比如我們的RNA使用DEPC溶解的，就用DEPC 進(jìn)行調(diào)零），放下探頭（如果"Blank"右側(cè)為"ON"：則自動(dòng)調(diào)零，如是"OFF"，需要手動(dòng)點(diǎn)擊"Blank"按鍵），儀器就會(huì)以DEPC為空白對(duì)照，進(jìn)行調(diào)零。 ④將加樣表面和上探頭的DEPC都用濾紙吸去，加入 1-2μl RNA 樣品于加樣表面上，放下上探頭（如果"Measure"右側(cè)為"ON"：，則自動(dòng)測(cè)量，如是"OFF"，需手動(dòng)點(diǎn)擊"Measure"按鍵），儀器開(kāi)始定量檢測(cè),得到濃度，A260/A280， A260/A230等信息，繼續(xù)擦去RNA，滴加下一個(gè)樣本。⑤檢測(cè)完成后，點(diǎn)擊結(jié)束實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)⑥測(cè)量結(jié)束后，吸去樣品，加2μl蒸餾水，放下上探頭，以清潔儀器表面。吸去蒸餾水，放下上探頭。選擇左上角菜單鍵彈出菜單，選擇home回到主頁(yè)。得到RNA濃度之后，就可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟（根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒確定反轉(zhuǎn)錄體系）：這里以賽默飛RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit兩步法試劑盒為例子，不同實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒不同，根據(jù)說(shuō)明書(shū)就可以了具體步驟：第一步進(jìn)行RT 1：首先我們需要確定RNA和水的量，根據(jù)說(shuō)明書(shū)合成第一鏈的步驟中模板 RNA（總 RNA） 的量在0.1 ng-5 µg中都可以，所以示例中我們就按照4μg的RNA量來(lái)計(jì)算：計(jì)算出所需RNA和水的體積，如下說(shuō)明書(shū)12μL體系中1μL Oligo (dT)₁₈ primer和1μL random primer,剩余水加RNA=10μL所需RNA的體積=4000/RNA濃度；水的體積=10-RNA的體積之后可以將Oligo (dT)₁₈ 和random primer配成mix，記作RT1，比如這里有8個(gè)RNA需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，那么RT1=10μ random+10 Oligo (dT)₁₈ ，一般會(huì)多配兩個(gè)，也就是10個(gè)體系的量取出8聯(lián)管，做好標(biāo)記，依次加入水，RNA以及RT1 mix可選步驟：若 RNA 模板富含 GC 或存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，輕輕混勻后短暫離心，在 65°C 下孵育 5 分鐘；隨后置于冰上冷卻，短暫離心，再將試管放回冰上。具體步驟：第一步進(jìn)行RT 2：先配置RT2 mix:現(xiàn)在有10個(gè)樣本需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將體系中所需的試劑量都×10，混合在一起配成RT2 mix，在8連管中添加8μL的RT2 mix孵育條件： 設(shè)置PCR儀程序：若使用 Oligo (dT)₁₈引物或基因特異性引物引發(fā) cDNA 合成，在 42°C 下孵育 60 分鐘；若使用隨機(jī)六聚體引物引發(fā)合成，先在 25°C 下孵育 5 分鐘，再在 42°C 下孵育 60 分鐘。若 RNA 模板富含 GC，可將反應(yīng)溫度提高至 45°C。之后在 70°C 下加熱 5 分鐘終止反應(yīng)。這樣子就完成了RNA的反轉(zhuǎn)錄。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
085701環(huán)境工程專(zhuān)碩求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
0817化學(xué)工程319求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
伙伴們，祝我生日快樂(lè)吧
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
274求調(diào)劑0856材料化工
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
337一志愿華南理工0805材料求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
（081700）化學(xué)工程與技術(shù)-298分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
NSFC申報(bào)書(shū)里申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷中代表性論著還需要在申報(bào)書(shū)最后的附件里面再上傳一遍嗎
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
一志愿北京化工大學(xué)材料與化工296分求調(diào)劑
已經(jīng)有17人回復(fù)
-
0703化學(xué)一志愿211 總分320求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研戰(zhàn)神來(lái)了 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考博] 讀博申請(qǐng) +5 | 感dd 2026-03-10 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 341求調(diào)劑 +3 | 搗蛋豬豬 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料工程085601調(diào)劑求老師收留 +8 | 強(qiáng)木木木 2026-03-07 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿浙江大學(xué)0856材料與化工求調(diào)劑 +3 | yansheng@211 2026-03-09 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑，307分 +12 | 張泳銘1 2026-03-09 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +8 | 小木蟲(chóng)085600 2026-03-09 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 0817一志愿蘇州大學(xué)280復(fù)試調(diào)劑 +9 | kk扛 2026-03-07 | 9/450 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
PDF在線壓縮軟件
 10+3
|
haxia 2026-03-08 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 2026博士申請(qǐng) +6 | 起泡酒 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 070300化學(xué)求調(diào)劑 +5 | 撲風(fēng)鈴的貓 2026-03-08 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑，一志愿山東大學(xué)材料與化工，328分，政治51 +5 | 關(guān)你西紅柿929 2026-03-08 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 中科大材料299求調(diào)劑 +10 | DAIjiayo 2026-03-05 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +4 | xxxcm 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +3 | squirtle11 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求0856調(diào)劑 +5 | 小力氣珂珂 2026-03-08 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 進(jìn)入個(gè)人成果庫(kù)好難，一下午都沒(méi)進(jìn)去 +6 | mi_dilee 2026-03-05 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程317分求調(diào)劑 +9 | 6汆尼9 2026-03-07 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 322分 085600求調(diào)劑，有互聯(lián)網(wǎng)+國(guó)金及主持省級(jí)大創(chuàng)經(jīng)歷 +4 | 熊境喆 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈爾濱工業(yè)大學(xué)0856材料與化工，前三科206，總分283，求調(diào)劑 +7 | 26考研求調(diào)劑 2026-03-06 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +5 | ws 上岸鴨 2026-03-05 | 5/250 |
|