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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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[交流]
RNA濃度測(cè)定及反轉(zhuǎn)錄詳細(xì)步驟
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| 前面我們介紹了RNA提取的步驟Trizol法提取RNA原理及詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟，提取得到的RNA使用DEPC水進(jìn)行溶解后，用Nanodrop進(jìn)行RNA濃度的檢測(cè)。1Nanodrop檢測(cè)RNA濃度的實(shí)驗(yàn)步驟 ①打開 Nanodrop 儀器電源，選擇檢測(cè)樣本的類型②測(cè)試前先進(jìn)行基座清潔：用移液器吸取2μl蒸餾水加到檢測(cè)基座上，將樣品臂放下，浸泡2-3分鐘，用無塵紙將檢測(cè)基座擦拭干凈。③調(diào)零：清潔基座后，在下探頭上加2μl DEPC（使用與樣品對(duì)應(yīng)的溶液，比如我們的RNA使用DEPC溶解的，就用DEPC 進(jìn)行調(diào)零），放下探頭（如果"Blank"右側(cè)為"ON"：則自動(dòng)調(diào)零，如是"OFF"，需要手動(dòng)點(diǎn)擊"Blank"按鍵），儀器就會(huì)以DEPC為空白對(duì)照，進(jìn)行調(diào)零。 ④將加樣表面和上探頭的DEPC都用濾紙吸去，加入 1-2μl RNA 樣品于加樣表面上，放下上探頭（如果"Measure"右側(cè)為"ON"：，則自動(dòng)測(cè)量，如是"OFF"，需手動(dòng)點(diǎn)擊"Measure"按鍵），儀器開始定量檢測(cè),得到濃度，A260/A280， A260/A230等信息，繼續(xù)擦去RNA，滴加下一個(gè)樣本。⑤檢測(cè)完成后，點(diǎn)擊結(jié)束實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)⑥測(cè)量結(jié)束后，吸去樣品，加2μl蒸餾水，放下上探頭，以清潔儀器表面。吸去蒸餾水，放下上探頭。選擇左上角菜單鍵彈出菜單，選擇home回到主頁(yè)。得到RNA濃度之后，就可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟（根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒確定反轉(zhuǎn)錄體系）：這里以賽默飛RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit兩步法試劑盒為例子，不同實(shí)驗(yàn)室使用的試劑盒不同，根據(jù)說明書就可以了具體步驟：第一步進(jìn)行RT 1：首先我們需要確定RNA和水的量，根據(jù)說明書合成第一鏈的步驟中模板 RNA（總 RNA） 的量在0.1 ng-5 µg中都可以，所以示例中我們就按照4μg的RNA量來計(jì)算：計(jì)算出所需RNA和水的體積，如下說明書12μL體系中1μL Oligo (dT)₁₈ primer和1μL random primer,剩余水加RNA=10μL所需RNA的體積=4000/RNA濃度；水的體積=10-RNA的體積之后可以將Oligo (dT)₁₈ 和random primer配成mix，記作RT1，比如這里有8個(gè)RNA需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，那么RT1=10μ random+10 Oligo (dT)₁₈ ，一般會(huì)多配兩個(gè)，也就是10個(gè)體系的量取出8聯(lián)管，做好標(biāo)記，依次加入水，RNA以及RT1 mix可選步驟：若 RNA 模板富含 GC 或存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，輕輕混勻后短暫離心，在 65°C 下孵育 5 分鐘；隨后置于冰上冷卻，短暫離心，再將試管放回冰上。具體步驟：第一步進(jìn)行RT 2：先配置RT2 mix:現(xiàn)在有10個(gè)樣本需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將體系中所需的試劑量都×10，混合在一起配成RT2 mix，在8連管中添加8μL的RT2 mix孵育條件： 設(shè)置PCR儀程序：若使用 Oligo (dT)₁₈引物或基因特異性引物引發(fā) cDNA 合成，在 42°C 下孵育 60 分鐘；若使用隨機(jī)六聚體引物引發(fā)合成，先在 25°C 下孵育 5 分鐘，再在 42°C 下孵育 60 分鐘。若 RNA 模板富含 GC，可將反應(yīng)溫度提高至 45°C。之后在 70°C 下加熱 5 分鐘終止反應(yīng)。這樣子就完成了RNA的反轉(zhuǎn)錄。 |
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