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科研戰(zhàn)神來了新蟲 (小有名氣)
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泛素化IP實驗 | 詳細步驟+小tips 已有1人參與
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泛素化IP實驗步驟 一、制備細胞裂解物 1.實驗組/對照組分別準備1個10cm圓皿的細胞，收集細胞前加MG132處理4-6h 2.棄舊培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，棄PBS 3.將皿置于冰上預(yù)冷，加入500-1000μL RIPA（100:1添加PMSF），冰上裂解10-15min后，用細胞刮將蛋白刮下，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管 4.冰浴中對樣品超聲3-5次，每次3秒 1.4℃,16000g離心8min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細胞裂解物二、共孵育（抗體＋蛋白） 1.取出40-100μL 樣品作為input先放入-20或-80℃冰箱 2.在剩余樣品加目的抗體（1-2μg），用封口膜將反應(yīng)管封嚴 3.4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜 三、共沉淀（加磁珠） 1.清洗磁珠（可以不洗，將原管磁珠重懸后取30μL加到反應(yīng)管中即可）：用IP裂解液清洗磁珠3遍（磁力架），IP裂解液重懸磁珠（取多少μL就用多少液體量重懸），為了防止在吸取磁珠時槍頭將磁珠損傷，可以將槍頭用剪刀剪去前端一小部分使用 2.將磁珠加入到每個免疫沉淀反應(yīng)中（30μL/管），重新封嚴反應(yīng)管 3.4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜*（這一步看很多Protocol都是孵育1-4h，之前我有個抗體做IP孵育4h沒做出來，有次孵育過夜做出來結(jié)果很漂亮，后面就都是過夜孵育了） 四、清洗（洗去非特異結(jié)合） 1.將IP反應(yīng)管取出置于磁力架上，將磁珠吸附至管壁，待溶液澄清后，將上清液去除，留磁珠 2.加1mL PBST，將樣品管從磁力架取下，在4℃摩天輪旋轉(zhuǎn)清洗3-5min，重復(fù)1和2步驟兩次，即用PBST洗3次 3.加入1mL IP裂解液，將樣品管從磁力架取下，在4℃摩天輪旋轉(zhuǎn)清洗3-5min，將液體轉(zhuǎn)移至新的離心管（原離心管可能吸附有蛋白，避免非特異），置于磁力架吸附磁珠，棄上清，再用IP裂解液洗1遍 *清洗液可以全部用PBS 五、洗脫（將蛋白從珠子上洗脫） 1.將Loading buffer用IP裂解液稀釋成1x 2.每個IP反應(yīng)管加入30-40μL 1x Loading buffer，渦旋混勻，金屬浴100℃煮樣5-10min，即制樣完成 3.將離心管放入磁力架，取上清進行上樣電泳 ⭐泛素化IP實驗和coIP實驗差不多，但有些地方不同～下面講一下泛素化IP實驗比較關(guān)鍵的點 收樣前需要加MG132處理4-6小時，目的為了“凍結(jié)”和“富集”處于泛素化狀態(tài)的蛋白質(zhì)，從而增強實驗信號，確保能夠成功檢測到通常瞬態(tài)且低豐度的泛素化修飾。 ✅為什么泛素化IP可以用強裂解液而coIP不能？ Co-IP的目的是捕獲蛋白A和蛋白B之間天然狀態(tài)下的物理結(jié)合，強裂解液中的SDS和強去污劑會破壞氫鍵、疏水區(qū)域等，從而瓦解蛋白質(zhì)的三級/四級結(jié)構(gòu)和非共價相互作用。一旦蛋白質(zhì)變性，其表面的結(jié)合位點就會消失，A和B之間的自然相互作用就會被徹底破壞。 泛素化IP的目的是證明泛素分子是否通過共價鍵連接在了目標蛋白上，強去污劑和低濃度的SDS無法破壞這種共價連接。使用強裂解液可以徹底變性目標蛋白，使被泛素化的目標蛋白完全展開，暴露出原本藏在內(nèi)部的泛素化位點，讓抗體更容易結(jié)合；強裂解液可以解離所有非共價的、假性的相互作用，消除非特異結(jié)合 ✅泛素化IP樣品處理時需要超聲，充分暴露泛素化位點 跑泛素化條帶時一定要用避免輕重鏈二抗，泛素化修飾的典型WB特征是一個連續(xù)的拖尾或涂抹狀條帶，重鏈的強信號條帶會影響泛素化條帶的檢出，用普通二抗只能曝出重鏈，用了避免輕重鏈二抗后泛素條帶就可以曝出來了。 |
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