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[交流]
細胞蛋白如何提取，簡化版步驟來了（附注意事項和閉坑指南）
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一、細胞蛋白提取全流程 1. 實驗前準備 - 裂解液：RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑+1%磷酸酶抑制劑，現(xiàn)用現(xiàn)配）； - 預冷設(shè)備：離心機（4℃）、冰盒、預冷PBS、凍存管； - 耗材：細胞刮刀（或胰酶消化法）、200μL/1.5mL EP管。 2.操作步驟 - A [棄培養(yǎng)基] --> B [預冷PBS洗2次]； - B --> C [加入裂解液 <br>（6孔板：每孔100μL）] ； - C --> D [冰上裂解30min <br> 每10min渦旋震蕩15s]； - D --> E [4℃12000g 離心15min]； - E --> F [吸取上清至新EP管]； - F --> G [-80℃分裝保存]。 二、致命失誤閉坑指南 - 裂解液用量：細胞鋪滿80%的6孔板 → 100μL/孔（過多導致蛋白稀釋，過少裂解不充分）； - 抑制劑失效：蛋白酶抑制劑需-20℃避光保存，解凍后24h內(nèi)用完； - 離心溫度：必須預冷離心機至4℃，否則蛋白降解。 三、關(guān)鍵注意事項 - 抑制降解：全程在冰上操作（裂解液接觸細胞前必須預冷）； - 避免泡沫：渦旋震蕩時勿產(chǎn)生氣泡（導致蛋白變性）； - 核酸污染：高粘度樣本需加DNase/RNase（否則WB條帶拖尾）。 |
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