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畢合生物2024銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
蛋白條帶連成一片？這幾個(gè)原因你得知道！
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做Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)，最怕的就是蛋白條帶連成一片！不僅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)的誤讀和誤解。今天就來(lái)給大家嘮嘮，蛋白條帶連成一片的原因，還有怎么解決，趕緊搬好小板凳，認(rèn)真聽(tīng)講啦！ 蛋白條帶連成一片的原因 1️⃣ 上樣量過(guò)高 最常見(jiàn)的原因就是蛋白樣品的上樣量過(guò)高啦！如果上樣量太多，蛋白條帶就會(huì)非常粗，相互連接在一起，導(dǎo)致分離不清晰。比如，marker旁邊兩條泳道的蛋白條帶非常粗，并且相互連接在一起，這就說(shuō)明上樣量太多了。 2️⃣ 蛋白未充分變性 如果蛋白沒(méi)有充分變性，分子間可能會(huì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致條帶連成一片。在上樣前，確保蛋白樣品在沸水浴中充分變性，通常需要加熱5-10分鐘。 3️⃣ 電泳時(shí)間不足 電泳時(shí)間太短，蛋白條帶可能還沒(méi)完全分開(kāi)，就會(huì)出現(xiàn)連成一片的情況。根據(jù)蛋白分子量和凝膠濃度，調(diào)整電泳時(shí)間，確保蛋白條帶充分分離。 4️⃣ 凝膠濃度過(guò)低 如果凝膠濃度過(guò)低，蛋白條帶之間的分離效果會(huì)變差，容易連成一片。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，選擇合適的凝膠濃度。一般來(lái)說(shuō)，小分子量蛋白適合高濃度凝膠，大分子量蛋白適合低濃度凝膠。 解決方法 1️⃣ 上樣量過(guò)高 在下一次進(jìn)行電泳時(shí)，將樣品稀釋5-10倍后再進(jìn)行上樣。每次蛋白提取后，進(jìn)行蛋白定量，并根據(jù)實(shí)際情況控制上樣量。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于常見(jiàn)的3.35mm孔寬、1mm厚的膠，上樣體積不要超過(guò)20μL，每個(gè)孔的蛋白含量控制在20-40微克范圍內(nèi)。 2️⃣ 確保蛋白充分變性 在上樣前，將蛋白樣品在沸水浴中加熱5-10分鐘，確保蛋白充分變性。加熱過(guò)程中，可以輕輕渦旋樣品，使其均勻受熱。 3️⃣ 調(diào)整電泳時(shí)間 根據(jù)蛋白分子量和凝膠濃度，調(diào)整電泳時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，小分子量蛋白電泳時(shí)間可以短一些，大分子量蛋白電泳時(shí)間需要長(zhǎng)一些。通常電泳時(shí)間為45-60分鐘，電壓控制在100-120V。 4️⃣ 選擇合適的凝膠濃度 根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，選擇合適的凝膠濃度。小分子量蛋白適合12-15%的高濃度凝膠，大分子量蛋白適合8-10%的低濃度凝膠。 SDS-PAGE電泳的小細(xì)節(jié) 1️⃣ 上樣體積控制 每個(gè)孔的上樣體積不要超過(guò)20μL，避免溢出污染其他孔道。 2️⃣ 上樣蛋白量控制 每個(gè)孔的蛋白含量控制在20-40微克范圍內(nèi)，確保蛋白條帶清晰分離。 3️⃣ 補(bǔ)齊剩余孔道 如果還有其他孔道空余，用loading buffer補(bǔ)齊，減少電泳過(guò)程中不同泳道遷移率不一致的情況。 畢合生物提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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