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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
蛋白條帶連成一片？這幾個原因你得知道！
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做Western Blot（WB）實驗，最怕的就是蛋白條帶連成一片！不僅影響實驗結(jié)果的準確性，還可能導致數(shù)據(jù)的誤讀和誤解。今天就來給大家嘮嘮，蛋白條帶連成一片的原因，還有怎么解決，趕緊搬好小板凳，認真聽講啦！ 蛋白條帶連成一片的原因 1️⃣ 上樣量過高 最常見的原因就是蛋白樣品的上樣量過高啦！如果上樣量太多，蛋白條帶就會非常粗，相互連接在一起，導致分離不清晰。比如，marker旁邊兩條泳道的蛋白條帶非常粗，并且相互連接在一起，這就說明上樣量太多了。 2️⃣ 蛋白未充分變性 如果蛋白沒有充分變性，分子間可能會發(fā)生聚集，導致條帶連成一片。在上樣前，確保蛋白樣品在沸水浴中充分變性，通常需要加熱5-10分鐘。 3️⃣ 電泳時間不足 電泳時間太短，蛋白條帶可能還沒完全分開，就會出現(xiàn)連成一片的情況。根據(jù)蛋白分子量和凝膠濃度，調(diào)整電泳時間，確保蛋白條帶充分分離。 4️⃣ 凝膠濃度過低 如果凝膠濃度過低，蛋白條帶之間的分離效果會變差，容易連成一片。根據(jù)目標蛋白的分子量，選擇合適的凝膠濃度。一般來說，小分子量蛋白適合高濃度凝膠，大分子量蛋白適合低濃度凝膠。 解決方法 1️⃣ 上樣量過高 在下一次進行電泳時，將樣品稀釋5-10倍后再進行上樣。每次蛋白提取后，進行蛋白定量，并根據(jù)實際情況控制上樣量。一般來說，對于常見的3.35mm孔寬、1mm厚的膠，上樣體積不要超過20μL，每個孔的蛋白含量控制在20-40微克范圍內(nèi)。 2️⃣ 確保蛋白充分變性 在上樣前，將蛋白樣品在沸水浴中加熱5-10分鐘，確保蛋白充分變性。加熱過程中，可以輕輕渦旋樣品，使其均勻受熱。 3️⃣ 調(diào)整電泳時間 根據(jù)蛋白分子量和凝膠濃度，調(diào)整電泳時間。一般來說，小分子量蛋白電泳時間可以短一些，大分子量蛋白電泳時間需要長一些。通常電泳時間為45-60分鐘，電壓控制在100-120V。 4️⃣ 選擇合適的凝膠濃度 根據(jù)目標蛋白的分子量，選擇合適的凝膠濃度。小分子量蛋白適合12-15%的高濃度凝膠，大分子量蛋白適合8-10%的低濃度凝膠。 SDS-PAGE電泳的小細節(jié) 1️⃣ 上樣體積控制 每個孔的上樣體積不要超過20μL，避免溢出污染其他孔道。 2️⃣ 上樣蛋白量控制 每個孔的蛋白含量控制在20-40微克范圍內(nèi)，確保蛋白條帶清晰分離。 3️⃣ 補齊剩余孔道 如果還有其他孔道空余，用loading buffer補齊，減少電泳過程中不同泳道遷移率不一致的情況。 畢合生物提供服務內(nèi)容：分子生物學、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學、材料化學、細胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學、天然產(chǎn)物 |
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