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畢合生物2024銅蟲 (小有名氣)
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RNA提取全攻略：Trizol法超詳細(xì)步驟
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做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，RNA提取可是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)！今天就來給大家詳細(xì)講講Trizol法提取RNA的全過程，超實(shí)用，趕緊碼��！ Trizol法提取RNA的基本原理 1️⃣ 細(xì)胞裂解 Trizol試劑里的異硫氰酸胍是個(gè)“狠角色”，能迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，讓核酸和蛋白質(zhì)都釋放出來。它還能抑制核酸酶活性，保護(hù)RNA不被降解，厲害吧！ 2️⃣ RNA分離 裂解后，加入氯仿離心。氯仿密度大，能和苯酚結(jié)合，把RNA趕到水相里，而DNA和蛋白質(zhì)則留在有機(jī)相或中間相。這樣，RNA就和其他成分分開了！ 3️⃣ RNA沉淀 收集上層水相，加入異丙醇，RNA就會沉淀出來。這一步超關(guān)鍵，決定了RNA能不能被成功回收。 4️⃣ RNA洗滌與純化 用乙醇洗滌RNA沉淀，去除雜質(zhì)和殘留溶劑。最后用無RNase的水溶解RNA，就得到純凈的總RNA啦！ 🌟 Trizol法中各個(gè)試劑的作用 1️⃣ Trizol試劑 異硫氰酸胍：強(qiáng)力蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，釋放RNA，還能抑制核酸酶活性。 苯酚：幫助裂解細(xì)胞，釋放核酸和蛋白質(zhì)，但需要和其他成分聯(lián)合使用才能更好地抑制RNA酶活性。 8-羥基喹啉：能抑制RNase活性，和氯仿聯(lián)合使用時(shí)效果更佳。 β-巰基乙醇：破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵，進(jìn)一步抑制RNase活性。 2️⃣ 氯仿 加速有機(jī)相和水相分層，讓RNA留在水相中，同時(shí)抽提少量苯酚，減少對RNA的損害。 3️⃣ 乙醇 去除沉淀中殘留的異丙醇和其他雜質(zhì)，提高RNA純度。 4️⃣ DEPC水 無RNase的水，防止RNA在溶解過程中被降解。 提取12孔板細(xì)胞RNA的超詳細(xì)步驟 1️⃣ 裂解細(xì)胞 12孔板每孔加入700 μL Trizol試劑，室溫裂解10分鐘，讓核酸蛋白復(fù)合物完全分離。然后用槍吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。 2️⃣ 加入氯仿 每管加入140 μL三氯甲烷（Trizol體積的1/5），劇烈震蕩15秒，室溫放置3分鐘。然后12000 rpm，4℃離心20分鐘，樣品會分成三層，RNA主要在上層水相中。 3️⃣ 收集水相 小心轉(zhuǎn)移上層水相（300 μL）至新的EP管中，操作要格外小心，不要吸取到有機(jī)相。加入等量體積300 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘，讓RNA沉淀。 4️⃣ 沉淀RNA 12000 rpm，4℃離心15分鐘，棄上清。然后加入1 mL 75%乙醇，8000 rpm，4℃離心5分鐘，重復(fù)2次洗滌，提高RNA純度。 5️⃣ 干燥RNA 離心結(jié)束后，用吸引器將乙醇吸取干凈，室溫放置晾干RNA沉淀，一般2-5分鐘即可，切勿干燥過度。 6️⃣ 溶解RNA 加入適量DEPC水，用槍頭吸打幾次，讓RNA充分溶解。 畢合生物提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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