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Abbkine亞科因新蟲 (初入文壇)
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細(xì)胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒（離心柱式）實(shí)驗(yàn)操作原理
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原理 細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，核酸內(nèi)切酶激活，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200 bp或其整倍數(shù)的DNA Ladder。DNA Ladder是細(xì)胞凋亡的一個重要指標(biāo)，通常觀察到DNA ladder，就可以判定細(xì)胞發(fā)生了凋亡。細(xì)胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒（離心柱式）通過DNA純化柱方式抽提DNA Ladder，比用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易損失，可以非常有效地抽提最小片斷為180-200bp的DNA Ladder，同時又可以抽提到50 kb以上的基因組DNA。 自備耗材 ·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、離心管 ·離心機(jī)、渦旋振蕩器 ·水浴鍋、凝膠電泳儀 ·無水乙醇、PBS ·瓊脂糖、TAE、Loading Buffer、DNA Marker、EB 試劑準(zhǔn)備 Lysis Buffer A：即用型；室溫保存。 Lysis Buffer B：即用型；室溫保存。 Wash Buffer A：第一次使用前50 T添加9 mL無水乙醇，100 T添加18 mL無水乙醇，混勻并做好標(biāo)記；室溫保存。 Wash Buffer B：第一次使用前50 T添加32 mL無水乙醇，100 T添加64 mL無水乙醇，混勻并做好標(biāo)記；室溫保存。 Elution Buffer：即用型；室溫保存。 RNase A：即用型；-20℃保存。 Proteinase K：即用型；-20℃保存。 實(shí)驗(yàn)步驟 注意：需使用56℃或70℃水浴，請?zhí)崆白骱脺?zhǔn)備。 A.細(xì)胞樣本 1.收集約1×106個細(xì)胞，加入200 μL PBS，輕柔混勻，使細(xì)胞重懸于PBS中。 注意：如果使用凍存的細(xì)胞沉淀，先把細(xì)胞沉淀解凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS重懸細(xì)胞。 2.加入2 μL RNase A，輕柔渦旋混勻,室溫放置3-5 min。 3.加入10 μL Proteinase K，輕柔渦旋混勻。 4.加入200 μL Lysis Buffer B，輕柔渦旋混勻，70℃孵育10 min。 注意：加入 Lysis Buffer B后必須立即渦旋混勻。不可把Proteinase K直接和Lysis Buffer B混合。 5.加入200 μL無水乙醇，輕柔渦旋混勻。 注意：加入乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，屬正�，F(xiàn)象。 6.把步驟5中的混合物（包括可能產(chǎn)生的沉淀）加入到Spin Column。12,000 rpm離心1 min，倒棄Collection Tube內(nèi)液體。 注意：進(jìn)行本步驟前需將Spin Column置于Collection Tube上。倒棄廢液后回收Collection Tube。必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到Spin Column內(nèi)，否則會嚴(yán)重影響抽提效果。 7.加入0.5 mL Wash Buffer A（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1 min，倒棄Collection Tube內(nèi)液體。 8.加入0.6 mL Wash Buffer B（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1 min，倒棄Collection Tube內(nèi)液體。 9.12,000 rpm離心2 min，去除殘留的乙醇。 10.將Spin Column置于一新的1.5 mL離心管上，開蓋室溫干燥3-5 min，加入50-100 μL Elution Buffer。室溫放置 1-3 min。12,000 rpm離心1-2 min。所得液體即為純化得到的總DNA。 注意：為提高DNA提取量，可以將Elution Buffer預(yù)熱至56℃再洗脫，也可將第一次洗脫所得溶液重新加入Spin Column進(jìn)行洗脫。 11.取部分抽提得到的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。 注意：如果細(xì)胞發(fā)生凋亡，即可觀察到典型的 DNA Ladder。電泳時一定要注意換用新鮮配制的電泳液，DNA凝膠也要用新鮮配制的電泳液配制并新鮮配制后使用。電泳時為獲取最佳的電泳效果使Ladder充分分開，電泳速度宜適當(dāng)慢一些，凝膠宜適當(dāng)長一些，而加樣孔宜更加扁平一些。選取適當(dāng)較薄的梳齒，往往會獲得更好的Ladder電泳效果。 B.動物組織樣本 注意：與培養(yǎng)細(xì)胞相比，動物組織樣本凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的部位不定、規(guī)律性差，取樣部位及取樣量的不同，均會顯著影響最終DNA Ladder的提取效果，建議有豐富經(jīng)驗(yàn)的用戶使用本試劑盒提取組織凋亡DNA Ladder。 1.稱取不超過25 mg的組織（脾臟不超過10 mg），剪切成盡可能小的碎片，加入190 μL Lysis Buffer A。 注意：請勿使用過多的樣品，過多的樣品會導(dǎo)致抽提效果下降。較小的組織碎片會使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可。 2.加入10 μL Proteinase K，輕柔渦旋混勻，56℃孵育直至完全裂解。 注意：在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。裂解的時間因組織不同而有所不同，通�？稍�1-3 h內(nèi)完成。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對抽提效果無任何負(fù)面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應(yīng)該呈可把Spin Column堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補(bǔ)救措施，可以把整個反應(yīng)體系放大一倍。也可組織樣本經(jīng)液氮研磨成面粉狀，縮短裂解時間。 3.加入2 μL RNase A，輕柔渦旋混勻,室溫放置3-5 min。 4.渦旋混勻15 s，加入200 μL Lysis Buffer B，渦旋混勻，70℃孵育10 min。 注意：加入Lysis Buffer B后需立即渦旋混勻。加入Lysis Buffer B后可能會產(chǎn)生白色沉淀，但大多數(shù)情況在70℃孵育后會溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會形成凝膠狀物，此時需劇烈晃動或渦旋樣品，以盡量破壞凝膠狀物。 5.后續(xù)步驟同A.5-A.11細(xì)胞樣本的步驟。 注意事項 1.溫度較低時Lysis Buffer A和Lysis Buffer B中可能會有沉淀產(chǎn)生，屬正�，F(xiàn)象。如有沉淀，56℃水浴孵育溶解沉淀，混勻后使用。 2.本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，所有離心也均在室溫進(jìn)行。 3.Collection Tube在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。 |
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